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1、几种酵母转化方法酵母转化原理：像酿酒酵母,线性化的转化 DNA和 Pichiapastoris基因组的同源区域发生同源重组,使得线性化 DNA产生稳定的转化子（Cregg et al., 1985; Cregg etal.,1989）.这样的整合方式显示极强的稳定性,即使多拷贝转化子在没有选择压力的情况下也很稳定.单交换事件（插入）比双交换事件（置换）发生几率更大.单插入事件中约发生 1-10%概率的多插入事件.电转化注意点：一、 制备感受态的菌液收集时间：1、准确测定 OD值：OD 在 1.21.5 之间。1） 为了准确测定 OD值，建议将菌液稀释不同浓度测定（1、2、4、8、16 倍稀释，
2、看其 OD值是否呈线性关系） 。每个倍数做 35 个重复，应该可以大致推断OD值是否准确！菌液看上去浑浊，但 OD值不高，很可能 OD稀释倍数不够！2） OD值是否测准也可以这样估算：OD600 为 40左右时，菌体湿重（6000rpm离心 5min）约 0.95g/10ml。高密度发酵时菌体湿重将相应下降。2、75ml 的菌，经 18h左右的培养，最后 sorbital洗涤完毕后，50ml 离心管里所剩菌体特别浓，需要 1mlsorbitol才可溶解为糊状。正常培养的 OD在1.21.5 之间的 500ml菌液，收集的感受态也用 1ml稀释的，没那么粘稠。可以看看降低培养温度（27 摄氏度）
3、或缩短培养时间（12h） 。3、甚至不用转接,直接挑单克隆在 50100mlYPD 中摇过夜，效果也很好二、制备感受态的菌液量如果只转一个样品，50ml 就够了，一般 50ml的培养液如果 OD值正常的话够做10管感受态的，其他的按比例缩小。用大试管摇 5ml菌液，然后取 1ml毫升在1.5mlEP管中制感受态，每一步的离心时间 30秒就行。整个流程时间短，制备好的感受态用来做转化的效率很高。山梨醇离心，洗涤的过程之后的重悬的时候注意浓度，不要过于粘稠和稀释。三、感受态的保存感受态细胞做好后由于电转化杯还没有处理好等原因，在冰上放几个小时再做可能有一定的影响，尽量马上制备马上转化。如果感受态细
4、胞要保存，不需要加甘油，一般 80ul EP管分装，-70 或 -80 摄氏度保存。另附：酵母 GS115点种分离纯化接种 GS115于 5ml YPD液体培养基，30，200rpm 振荡过夜，涂布 YPD平板，30培养 48 小时，用 YNB 基本培养基和含 His的补充培养基作点种分离纯化，挑选在补充培养基生上生长而在基本培养基上不生长的单菌落划 YPD平板，4保存。四、电转化注意点：1、感受态做好后，最后一次吸出 sorbital时，不是直接倒调的，而是用毛细管轻吸出来的，这样可能使剩下的感受态纯净些。2、最后用毛细管取出 100ul出来，加入质粒，混匀！（怕量不够，吸得很多，电转时效果
5、反而不好。 ）3、电转杯清洁处理:一般先冲洗，洗净；然后浸泡在 75%的乙醇中；使用前我们都是放在超净台上，开启紫外，边吹风晾干，边进行紫外照射。电转杯的新包装或重复使用可能对转化率有一定的影响。4、电击的时候，电压数以及电击时间可以摸索一下，适当增加电压或者延长电击时间都可以。电击条件比如 1.5kv，放电 4.85.5ms。电击所有过程都要尽量在冰上进行，电击时间可以减少一点，设置为 5ms左右，电击之后马上加入预冷的山梨醇溶液，转移至 EP管，30 度静止培养 1h。如果菌体悬液浓度比较大的时候，在制备感受态的时候要留心一下操作中的问题了。5、电击之后，加入 1ml的山梨醇，吸入 1.5
6、ml的 ep管中，置于 30度摇床低速培养 1h，再涂板。6、注意的是处理液中的 DTT是在使用前加入，其它配好后于 4度保存，DTT单独于-20 度保存，可配成 100倍的贮备液。7、转化后 1ml用 sorbitol重悬的细胞悬液不能全部涂在一块板子上，按标准程序制作的感受态一般 3块左右可能比较合适，以干燥后看见一薄层淡淡的白色为宜。转化子会在白色的薄层上长出圆韵、饱满的大菌落的。五、转化试剂和培养基的正确准备方法1、MD 板子提前几天做好，放在冰箱里，涂板的时候吸收效果会好些。如果是新板子，可能吸收不是太好，板子上有些积层，反而不利于生长。2、YNB42 度水浴一会，然后过滤除菌，YN
7、B 是加到培养基里面的，去离子水 pH偏低，建议直接用蒸馏水就可以（关系不是太大） 。3、山梨醇，以及无菌去离子水均是冰冻，存放在 4度冰箱中4、一般用 10ug以上质粒用 SalI酶切，然后直接加乙醇沉淀，70乙醇洗一遍，约 20ulddH2O重溶。转化效率一般大于 100个克隆每 ugDNA。有人用 LiCl和DTT处理细胞，转化效率很高，可以试试。建议你不要用胶回收 kit，回收的DNA可能还有盐，导致电击时放电时间很短。5个电转化方案方法一：高效1.收集菌体取 1mlGS115过夜培养物（OD 约 6-10） 分装到 1.5ml EP管中，4、10000g 离心 1min，弃上清，沉淀
8、用无菌水（4）洗涤，同样条件下离心，弃上清。2.菌体处理加入 1ml处理液，室温下放置 20min。处理液：10mM LiAc10mM DTT0.6M sorbitol10mM TrisHCl（pH7.5）3.离心，弃上清，加入 1ml 1M sorbitol ，离心，弃上清，4.用 1M sorbitol洗涤二次，到最终体积约为 80l.（菌体太多可适当弃去部分）5.加入 10l.经过 Bgl酶切处理的工程质粒，混匀后转入 电击杯中，冰浴5min.6.电转. 1.5kv，25F，200 条件下进行电转。7.电击后立刻加入 1mL 1M sorbitol，吸出后于 30培养 2h。8.取一定量
9、涂平板（YPDS + Zeocin，涂布的量分别为 100、200 微升，剩余的经离心处理后全部涂在一个平板上）有一点要注意的是处理液中的 DTT是在使用前加入，其它配好后于 4度保存，DTT单独于-20 度保存，可配成 100倍的贮备液。方法二：按下面步骤转化,开始每个板子只长了一二十菌落;小细节修改后,每个板长了约 100个.步骤如下：1、目的 DNA（pPIC9K） ，经电泳检测已经线性化（SalI 酶切） ；2、DNA 纯化方法是经酚仿氯仿两步抽提后，无水乙醇沉淀的，目测定量应足够；3、GS115 甘油菌经新鲜平板复苏后，5ML 培养过夜，16h 左右后，取菌 1：100稀释，接种于
10、70ml菌液扩大培养，14h 后测得 OD600约 1.3左右。4、将 sorbital、水和菌液均冰浴；5、菌液离心 5min100ml 冰水洗涤50ml 冰水洗涤4ml sorbital洗涤，然后溶解于 300ul冰 sorbital；6、加入约 510ug 的 DNA，枪吹匀，置 0.2CM电转杯静置 5min；7、电击，1,5KV.8、立即加入 1ml冰浴的 sorbital，静止 10min。9、取 100ul转化液，涂布 10cm的 MD平板。做了一点修改每块板子大概能长 100来个菌落（一般需要 2天左右）：1、菌液收集时间：以前可能是 OD值测得不太准确，我然后把菌液分别做了1
11、、2、4、8、16 倍稀释，看其 OD值是否呈线性关系。1、菌液测 OD值时，建议将菌液稀释不同浓度测定，这样才准确些。菌液看上去浑浊，但 OD值不高，很可能就是你的 OD稀释倍数不够！你分别稀释 2倍、4 倍、8 倍、10 倍等，每个倍数做 35 个重复，应该可以大致推断 OD值是否准确！2、我开始是先挑单克隆于 5mlYPD中，过夜 16h后，转接于 50mlYPD中，培养大概 18个小时吧。OD 值是否测准可以这样估算：OD600 为 40左右时，菌体湿重（6000rpm 离心 5min）约 0.95g/10ml。高密度发酵时菌体湿重将相应下降。测 OD，用什么作空白对照呢？菌体稀释液，
12、我一般使用 PBS3、电击条件等上面帖子上都有，1.5kv，放电 4.85.5ms。2、其它做法相同，就是感受态做好后，最后一次吸出 sorbital时，不是直接倒调的，而是用毛细管轻吸出来的，这样可能使剩下的感受态纯净些。3、最后用毛细管取出 100ul出来，加入质粒，混匀！（我以前怕量不够，吸得很多，电转时效果反而不好。 ）4、MD 板子提前几天做好，放在冰箱里，涂板的时候吸收效果会好些。如果是新板子，可能吸收不是太好，板子上有些积层，反而不利于生长。5、你说的 YNB，我用的是成品，只需要直接配制。42 度水浴一会，然后过滤除菌。我没有加硫酸铵。YNB 是加到培养基里面的，去离子水 pH
13、偏低哦，我建议直接用蒸馏水就可以了（关系不是太大） 。方法三：简便独特在筛选高表达菌种中，与大多数人和说明书有区别（成功做出几个基因）:每次转化前，均用多种酶 BlgII/salI/sacI同时切，转化时，用GS115/KM71/KM71H同时转化，转化的条件也和大家一样，即 1.5/25/200,但是我用的是 0.1的杯子，不是 0.2的，转化后涂 MM及 YPD+0.25G，长出菌落后，即进行大规模的表达试验，直接用 YPD表达的，一般 48h后即进行大量的 SDS-PAGE鉴定，鉴定时，样品不用浓缩，直接上样，看到目的带后再做 PCR，测序。方法四：没有转化子（无 aa的 YNB和硫酸铵
14、称好后，去离子水溶解，然后高压灭菌）1.挑取酵母单菌落，接种至含有 50ml YPD培养基的三角瓶中，30、250-300rpm培养过夜约 14h，OD600 约 1.32.菌液离心 5min50ml 冰水洗涤25ml 冰水洗涤2ml sorbital洗涤，然后溶解于 200ul冰 sorbital；两管分装，每管 100ul3.加入约 510ug 的线性化的 DNA20ul，枪吹匀，置 0.2CM电转杯冰浴 5min；4.电击，1,5KV.使用的是 Eppendorf 2510，用于转化细菌及酵母。5.立即加入 1ml冰浴的 sorbital，静止 1h。将菌体悬液涂布于 MD平板上，每 3
15、00l涂布一块平板；方法五: 和说明书差不多的方法X33菌株于 100ml YPD摇到 OD600约 1.1-1.3，太高影响感受态效率（1） 15001700g 离心 5min，将离心管倒置在吸水纸上轻轻控几下，充分弃上清（2） 加入 100ml 冰浴的超纯水 ddH2O，可在振荡器上振荡混匀，可静置 35分钟（3） 离心，弃上清，再加 100ml ddH2O洗一遍（4） 离心，弃上清，加 20ml 冰浴 1M Sorbitol洗一遍（5） 离心，弃上清，菌体置于冰浴中，加入约 100200ul Sorbitol 混匀加入 Sorbitol量需自己调整，这时菌液很浓，只要能够用 200ul黄
16、枪头吸出来就可以了，一般共有约 400500ul，够做几管感受态了。（7） 吸取 100150ul 感受态到线性化的 DNA中，用枪头打匀或手指弹匀静置 5min，于 2mm电转化杯中，电击参数：1.5KV，25uF，200 欧姆（不是400） ，一般放电时间在 4.5-4.9ms之间，小于 4说明你的 DNA盐浓度太高（9） 立即加入 1ml Sorbitol，转入 10ml 离心管，30 度静置 1小时，然后加入 1ml YPD，30 度，200rpm 摇 1小时，取 50200ul 菌液涂 100ul/ml YPDS板（10） 一般转化效率可以达到：200 个以上转化子每 200ul菌液，足够筛选表达菌株了。方法六:酵母感受态细胞的制备 接种 Pichia pastoris GS115于 5 ml YPD液体培养基，30，250300250 rpm ，过夜。 取 200l的培养物接种至含有 500ml新鲜培养基的三角摇瓶中，2830、250300
