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1、抗体生物素标记操作方法一般每个抗体可以标记3-5个生物素，标记时，生物素与抗体的比率受抗体浓度影响，对于10 mg/ml 的抗体溶液来说，生物素应超过蛋白12倍（摩尔数） ，对于2 mg/ml 的抗体溶液应超过20倍，生物素也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中。蛋白样品不得含有叠氮钠、BSA、甘氨酸、Tris 或其他任何有自由氨基的添加物。一、试剂和器材：1、 标记反应溶液：0.1M pH 7.2 PBS（0.15M sodium chloride ）NaCl 8.77 g ；Na 2HPO412H2O 32.3g ；NaH 2PO42H2O 4.5g；加双蒸水 900mL 左右，用 HCl/
2、NaOH 调 pH 至 7.2，最后定容为 1000mL2、 10mM NHS-dPEG4-Biotin 配方：称取0.56mg NHS-dPEG4-Biotin（分子量为587） ，溶解于95 l 超纯水中，临用前配置，不可储存，立刻使用。NHS-PEG4-Biotin 容易潮解，开瓶前平衡至室温。 也可以配置 200 nmol/L 储备液：20mg NHS-dPEG4-Biotin 溶解于170l DMSO 中，-20稳定几个月。由于 NHS-PEG4-Biotin 昂贵，而且使用量少，不能保存，配制时，直接将NHS-PEG4-Biotin 放入1.5ml EP 管中，以实际称量的 NHS
3、-PEG4-Biotin 按比率加入超纯水。3、超滤管、Millipore 超滤管0.5ml 10KD:截留分子量10KD，残留体积200l，蛋白回收率95%，7500 g（允许的最大离心力14000g）离心10min。、Millipore 超滤管0.5ml 50KD:截留分子量50KD，残留体积80l，蛋白回收率94%，7500 g（允许的最大离心力14000g）离心5 min。、Amicon Ultra -0.5ml 离心超滤管（Millipore） ，效果更好，典型的最终浓缩物体积：5-15ul。二、抗体超滤处理标记前需要应用截留分子量为 50kDa 的超滤柱对抗体进行标记前纯化处理(如
4、果不是抗体，一定要按蛋白分子量来确定超滤柱截留分子量)，以除去蛋白样品中可能含有的叠氮钠、BSA、甘氨酸、Tris 或其他任何有自由氨基的添加物，防止干扰标记反应。具体操作步骤：1、 于超滤柱中加入 200l 标记反应溶液，加入 500ug 单克隆抗体，混匀。2、 4，6000rpm，离心 2min。弃滤液。3、于超滤柱中加入 100l 标记反应溶液，混匀。4，Max 14000g，2min 。4、 重复步骤 2 6 到 7 次。5、 混匀超滤柱中的残留的液体，室温静置 1min。6、 将超滤柱反转倒置于一新的超滤管中，4，1000g，2min，收集滤液。7、 取 50l PBS 于超滤柱中混
5、匀，静置 1min。8、 倒置超滤柱，4，6000rpm，2min。收集滤液，与步骤 6 的滤液合并，4放置备用。用标记反应溶液调节抗体浓度到 2mg/ml （0.25ml） 。三、生物素标记抗体1、 计算抗体标记需要生物素用量。 抗体浓度 2 mg/ml 时的简要计算：1mL of 2 mg/mL IgG (150,000 MW)需要 26 L of 10mM NHS-PEG4-Biotin具体计算方式见附录一（标记生物素计算）2、 超滤后的滤液加入 NHS-PEG4-Biotin 溶液，室温反应 1h。3、 葡聚糖凝胶分离纯化(去除游离生物素)：四、葡聚糖凝胶分离纯化标记抗体操作步骤：（一
6、） 、试剂：1、纯化柱处理液 :100 mmol/L Na0H; 2、纯化柱平衡液: 50mmol/L Tris-HCl 缓冲液(pH7.4)，每升含 0.5g NaN3 ，8g NaCl;3、样品洗脱液:同纯化柱平衡液;4、标记抗体保护液（50）: 10ml0.01M pH7.2 PBS 中加入 0.5g BSA，0.2g NaN3 。（二） 、凝胶过滤：方法见“凝胶过滤法纯化微量标记蛋白”五、标记抗体的长期保存方法将“标记抗体保护液（50） ”加入到标记抗体溶液中，使 BSA 终浓度为0.1%，4 或-20 保存。六、数据记录：抗体浓度： mg/ml 加入抗体体积： l标记前抗体体积： l
7、 加入 NHS-PEG4-Biotin 体积： l纯化柱规格： cm cm 凝胶体积： ml加入标记抗体体积： l 所有洗脱溶液 1ml/管收集，到核酸蛋白检测仪显示出峰后，改为 0.5ml/管收集，并记录数据：管号 1 2 3 4洗脱液体积A280管号 5 6 7 8洗脱液体积A280管号 9 10 11 12洗脱液体积A280附录：1、标记生物素计算：1、不同抗体浓度时，抗体与 Sulfo-NHS-Biotin 的比率：Sulfo-NHS-Biotin MW：5892、10mmol/L Sulfo-NHS-Biotin 配方：3、标记生物素计算加入体积计算：Sulfo-NHS-Biotin
8、：抗体抗体浓度10-12mg/ml 时 12抗体浓度4-7mg/ml 时 16抗体浓度1-3 mg/ml 时 20抗体浓度0.5mg/ml 时 50Sulfo-NHS-Biotin （mg) PBS（l)Sulfo-NHS-Biotin （mg/l)0.56 95.1 0.00589计算公式抗体浓度 2 mg/ml 时*抗体浓度（ mg/ml） 4.5抗体加入量（ml) 0.11抗体加入量（mg) 抗体浓度 抗体加入量 0.495抗体的毫摩尔数（其他蛋白注意分子量） 抗体加入量/1500000 0.0000033需要的活化 Biotin 量（mmol） 抗体的毫摩尔数20 0.000066活化 Biotin 量（mg） Sulfo-NHS-Biotin 量（毫摩尔）589 0.038874需要10mmol/L 活化 Biotin 体积（l）活化 Biotin 量（mg）/活化 Biotin 浓度（mg/l) 6.6
