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1、各种培养基的配置及注意事项6-BA 配置：配置时要加入少量稀酸或 97%酒精，再加入蒸馏水，可适当加热。IBA 配置：配置时要加入少量稀碱，再加入蒸馏水。注意：配这两种溶液时，若直接加蒸馏水，则不溶。 （注：溶解生长素时，可用少量0.51N 的 NaOH 或 95%酒精溶解；溶解分裂素类用 0.51N 的 HCl 加热溶解，如再加蒸馏水，易产生白色沉淀，此时再加热水。 ）母液配置：母液 配置量 药品名称 称取量 倍数母液 1 250ml NH4NO3KH2PO441.5g4.25g100母液 1 250ml KNO3CaCl2.2H2O47.5g11g100母液 1 250ml MgSO4.7
2、H2O 9.25g 100母液 2 500mlMnSO4.H2OZnSO4.7H2OCaCl2.6H2OCuSO4.5H2ONa2MoO4KIH3BO3535mg215mg0.625mg0.625mg6.25mg20.75mg155mg500母液 3 250ml Na2.EDTAFeSO4.7H2O932.5mg695mg100母液 4 500ml烟酸VB6VB1肌醇甘氨酸12.5mg12.5mg2.5mg2.5g50mg1000MS 固体培养基：以配 1LMS 固体培养基为准：MS 固体干粉 41.5g蒸馏水 1L2g/l 的 6-BA 2.5ml2g/l 的 IBA 0.25ml注意：待溶
3、液配好后，用 pH 计将溶液的 pH 值调到 5.8 6.0，煮沸至均匀无沉淀后，分装 20 小瓶（即 50mL/瓶） ，灭菌之前盖子不要拧太紧，出锅后再拧紧盖子。MS 液体培养基：以配 1LMS 液体培养基为准：母液 1 5ml母液 1 10ml母液 1 5ml母液 2 1ml母液 3 5ml母液 4 1ml2g/l 的 6-BA 0.5ml2g/l 的 IBA 0.1ml蔗糖 30g注意：待溶液在烧杯中混匀之后，转移到 1000ml 的容量瓶中定容。LB 液体培养基：以配 1LLB 液体培养基为准：蛋白胨（TRYPTONE） 10g酵母提取液（YEASTExTrACT ） 5gNaCl 1
4、0g 注意：粉末在烧杯中溶解完全之后，转移到 1000ml 的容量瓶中定容。待灭菌结束后，温度降至 55左右（不烫手）时，加入 Kana(50mg/L)1000Ul(在超净台内进行)。LB 固体培养基：以配 1LLB 固体培养基为准：蛋白胨（TRYPTONE） 10g酵母提取液（YEASTExTrACT ） 5gNaCl 10g琼脂粉 15g注意：粉末在烧杯中溶解完全之后，转移到 1000ml 的容量瓶中定容。待灭菌结束后，温度降至 55左右（不烫手）时，加入 Kana(50mg/L)1000Ul(在超净台内进行)。 在进行到平板。组织培养体系的建立外植体获得具体操作：1将外植体（用镊子）夹到
5、其中一个空培养罐中2倒入 75%的酒精消毒 30S，重复三次。3倒入升汞消毒 4min，一次。4倒入蒸馏水清洗，重复三次。5盖上盖子，备用。6点燃酒精灯，在另一只空的培养罐中倒入些 75%的酒精（用于铁制仪器消毒）。7将铁架子在酒精灯上进行消毒，镊子和手术刀浸入培养罐中，然后放在酒精灯上灼烧，起杀菌作用。8用镊子夹住一培养皿在酒精灯上稍微烫下，灭菌。9在培养皿中倒入少量的蒸馏水。10 用经冷却的镊子将外植体夹到带少量蒸馏水的培养皿中，用刀切取其腋芽，将腋芽外的壳小心剥去，再在腋芽的尖端切一刀，使其暴露生长点。11 打开培养基瓶子之前在酒精灯上稍微烫下，打开瓶盖后，瓶口在酒精灯上灼烧下，以防污染
6、。12 用镊子将腋芽植入培养基中，瓶口灼烧下，旋紧盖子。注意：镊子和手术刀要经常灼烧，必要时可将镊子和刀柄进行高压灭菌，以防污染。1) 组织培养诱导芽再生具体操作：1. 点燃酒精灯，从装有酒精的培养罐中拿出刀和镊子在酒精灯上灼烧。2. 用镊子夹住一培养皿在酒精灯上稍微烫下，灭菌。3. 待刀和镊子冷却后，从一培养瓶中取出芽丛放在准备好的培养皿上。4. 用刀切取其嫩芽，并把老芽切短。5. 将嫩芽植入培养基中，通常是每瓶培养瓶中接 6 颗老芽或 7 颗嫩芽。注意点同上。2) 组织培养诱导根再生具体操作和注意点同上，不同是此过程只需要用到健壮的幼芽。3) 植物移栽、驯化具体操作：1. 从瓶中取出竹苗，
7、洗净培养基，2. 寄栽于育苗箱的基质上(珍珠岩砂壤土=11)，浇足定根水，定期喷洒营养液（MS 培养液） ，3. 用塑料膜调节温度、湿度和光照，4. 统计成活率及竹苗生长状况，待新发健壮根系后移往大棚。转基因体系的建立农杆菌培养具体操作：1. 挑取携带植物表达载体质粒的农杆菌单菌落。2. 接种在 50mg/LKana 的 LB 液体培养基中，28，160rpm 振荡培养过夜。3. 活化过夜的农杆菌按 1:50 的比例接种在相同的 LB 液体培养基中。4. 继续培养至对数生长期至 OD=0.30.6，测量时使用波长为 600nm，准备感染用。 农杆菌浸染预培养材料具体操作：1.5000rpm 离
8、心 20min，收集菌体。2.用 1/2MS 液体培养基（含有 50mg/L 乙酰丁香酮）悬浮准备感染用。3.将事先培养好的芦竹嫩芽浸入含有农杆菌菌液的液体 MS 液体培养基中。4.感染 20min30min，取出芦竹嫩芽用无菌滤纸吸去附着的菌液。共培养具体操作：将浸染过的芦竹嫩芽接种在含有 50mg/L 乙酰丁香酮（AS ）的固体 MS 培养基上，进行共培养。去除农杆菌具体操作：5. 若干天后，将芦竹从培养基中取出放入无菌水中冲洗，直至无菌水澄清。6. 再将芦竹加到 500mg/L 羧苄青霉素（Carb）的液体 MS 培养基，洗 5-10min。7. 取出芦竹嫩芽用无菌滤纸吸去附着的液体。8
9、. 将芦竹接到 500mg/L 羧苄青霉素(Carb) 和 10mg/L 潮霉素（Hygr ）固体MS 培养基上。培养具体操作：1.数天后，将芦竹从 500mg/L 羧苄青霉素和 10mg/L 潮霉素固体 MS 培养中取出。2.将其转接到只含有激素的固体 MS 培养基中中去。选择具体操作：通过观察，选择出抗性芽。根诱导及植株再生9. 待培养筛选的抗性芽长至 11.5cm 时。10. 切下并转入含有 500mg/L 羧苄青霉素和 10mg/L 潮霉素的生根培养基上诱导生根。11. 获得具有潮霉素素抗性的转基因植株。鉴定 PCR, Southern blot 分析基本按照 Sam brook 等的
10、方法。植物 DNA 经 Eco R I 或 H ind B am H I 酶切后, 在 018% 琼脂糖凝胶上电泳过夜.电泳缓冲液为 1TA E。DNA 片段分离开后通过毛细作用转移缓冲液为 10SSC。Southern N 分子杂交所用探针为 H ind B am H I 酶切 pROA 93 产生的 1 kb 片段, 此片段为 N PT 基因的一段编码顺序。 生物鉴定将芦竹放入含有磷的水中通过鉴定水中磷含量的变化来测定芦竹的聚磷效果。配置各种不同浓度培养基：00ml0.10.002ml0.50.01ml10.02ml20.04ml50.1ml100.2ml0 0ml 0.1 0.002ml
11、 0.2 0.004ml 0.5 0.01ml 1 0.02ml 2 0.04ml 注：表格中分别表示的是 6-BA 与 IBA 之间的比值，以及每一瓶（即每瓶40ml）培养基中所要加的激素的量。羧苄青霉素（Carb）和 潮霉素（Hygr）的配制：羧苄青霉素（Carb ）的作用： 杀菌，杀死植株体外的农杆菌。潮霉素（Hygr）的作用：选择性，杀死体内没有农杆菌侵入的植株。1. 称取固体粉末。2. 可用蒸馏水配置。3. 定容。4. 在超净台内用滤膜过滤，并将其分装入 EP 管中，用封口膜封口，放于20下冷藏，备用。Kana 的配置：卡那霉素的作用：筛选出抗性株。6-BAIBA1. 先计算出所要配
12、置的溶液浓度。2. 称好 Kana，用蒸馏水溶解，然后定容。3. 在操净台上用滤膜过滤，并将其分装入 EP 管中并放于20下冷藏。乙酰丁香酮（AS）的配置：乙酰丁香酮的作用：加速农杆菌侵染植株。1 称取固体粉末。2 先用甲醇或二甲基亚砜溶解，后加蒸馏水配置。3 定容。4 在操净台上用滤膜过滤，并将其分装入 EP 管中并放于20下冷藏。注意：如果用甲醇配置时需加热。加 Kana 的 MS 培养基配置方法：1. 先配好培养基。2. 分装入培养瓶中，每个培养瓶中加 40ml 培养基。3. 培养基进行高压灭菌。4. 灭好菌后，等到温度降到 5060到操净台上加 Kana。5. 事先算好每瓶所要加的抗生
13、素的量。6. 在加抗生素的过程中，速度要快，防止培养基凝固而影响实验的结果。关于 PCR：1. 引物（VP-6-F-1，VP-6-R-1）稀释于 TE（10mMTris-HCl PH8.0，1mMEDTA）溶液中，并于 20储存。2，PCR 反应液配置：从冰上将以下各成分加入 PCR 反应管中模板 DNA 1ulPrimer1（20um） 1ulPrimer2（20um） 1uldNTPs(10mMeach) 1ul10Taq Buffer 5ulTaq DNA polymerase 1uldiH2O（无菌水） 补充至 50ul注意： 模板 DNA 分为 1/1000,1/100 大肠杆菌悬液
14、以及空白对照；2dNTPs A、T、G、C 各加 10ul，再加入 360uldiH2O；3 反应管中溶液由多至少加入，TaqDNA polymerase 最后加入。3.手指轻弹反应管，使其混匀，简短离心，迅速放入 PCR.4.PCR 反应循环设置T=94 2min30 个循环T=94 40ST=52 1minT=72 2.5minT=72 7min关于制胶和跑胶：5. 制胶：琼脂糖 1g 溶于 100ml 水中，再加入 100ulEB，融三次倒胶再加梳子。6. 跑胶：EB 母液 25mg/ml 放置于冰箱中储存液 0.5mg/ml 需避光保存使用液 0.5mg/ml 加入胶中使用7. 跑电泳：
