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1、肠球菌耐万古霉素的机理及其检出方法国外医学临床生物化学与检验学分册 1999 年第 20 卷第 6 期天津市公安医院（300050） 蒋云华 王金良关键词：肠球菌 万古霉素自 1988 年英国首次发现耐万古霉素的肠球菌（VER）后，在全球迅速传播，且发展为多重耐药，使临床治疗极为困难。文献报告 VRE 所致的亚急性细菌性心内膜炎、败血症、盆腔内感染、尿路及伤口感染等日益增多。VRE 也是重要的医院内感染菌，已占医院内感染菌的第 4 位。对人类更具威胁性的是万古霉素依赖性肠球菌（VDE）出现，文献中至少已报告 6 例感染。因此，及时检出 VRE、VDE，对抢救感染患者，合理使用抗生素以及流行病学
2、调查均具重要意义。1 肠球菌耐万古霉素的分子生物学机制 万古霉素属糖肽类抗生素（包括替考拉宁、多糖菌素、杆菌肽等）系高分子量疏水化合物，它可与肠球菌细胞壁上的五肽糖前体的羧基末端 D-丙氨酸-D-丙氨酸结合形成复合体，从而阻抑了肽糖聚合所需的糖肽基和转肽反应，使肠球菌不再能合成细胞壁而死亡。 VRE 由于基因改变，使细胞壁的肽糖前体末端改变为 D-丙氨酸-D-乳酸盐，万古霉素即失去与之结合能力，肠球菌可照常合成细胞壁而存活。导致 VRE 形成的基因为分 VAN A、VAN B、VAN C 和 VAN D 基因型。VAN A、VAN B 基因为获得性， VAN C 基因为固有，VAN D 基因与
3、前两者的结构与作用相似，但临床意义尚不明确（表 1）。Sahm DF 用 BEAA（胆汁七叶苷叠氮钠琼脂）筛查 2777 份标本（2264 份尿、513 份粪便），2394 份（86）无肠球菌生长，共筛查出 206 株肠球菌，来自 121 名患者。经基因分析，其中 61 株（50）含 Van A 基因，9 株含 Van B（7），6 株含 Van A 和 Van B（50），38 株 Van C（31），其中 33 株含 Van C1，5 株含 Van C2，含 Van A、B 者均为粪肠球菌。表 1 肠球菌耐糖肽药物的基因型获得性 内源性Van A Van B Van C(C1 C2/C3)
4、 Van D万古霉素 MIC(mg/L) 641000 41000 232 1664替考拉宁 MIC(mg/L) 16512 0.51 0.51 24表达 可诱导 可诱导 不定 临床基因位置 质粒 染色体或质粒 染色体 意义转移元件 Tn1546 90-250Kb 尚未接合转移 确定修饰靶位 D-Ala-D-Lac D-Ala-D-Lac D-Ala-D-Ser菌株 尿肠球菌 尿肠球菌 鸡肠球菌 部分尿、粪肠球菌粪肠球菌 粪肠球菌 菜黄、黄色肠球菌表型鸟、坚韧、鸡孟氏，黄色鼠李糖、菜黄肠球菌Toye 等用 PCR 法自 601 份粪便检出了 34 株（5.7）Van C 的 VRE，自非粪便标
5、本 538 份中检出了 9 株（1.7），且证明 Van C 不在病人间转移，不必筛查。2 基因手段检出 VRE 及方法等比较 Endtz 等用 8 种人工与仪器的方法检测 VRE，与 PCR 法检查基因型相比较。基因型为 Van A 者 50 株，Van B 者 15 株，Van C150 株，Van C238 株，共 145 株，万古霉素敏感者 50 株为对照，结果发现不同方法对不同基因型的检测与 NCCLS 琼脂称释法相比有很大、大和小的错误（表 2）。表 2 七种方法检测 VRE 的错误率错误率（）很大 大 小方法Van A(n=50)Van B(n=15)Van C1(n=50)Va
6、n C2(n=30) (n=50)Van A(n=50)Van B(n=15)Van C1(n=50) Van C2(n=30)E 试验 0 0 0 0 0 0 13 2 0纸片扩散 0 0 0 0 2 0 27 50 37琼脂筛查 0 0 0 0 4Microscan普通板0 0 0 3 0 0 0 24 90快速板 0 33 0 0 0 0 27 14 10Vitek GPS-7A 0 40 0 0 4 0 13 28 37GPS-101 0 0 0 0 4 2 7 12 30表中有“很大的错误”：指参考琼脂稀释法为耐药，而此法测出敏感者。“大错误”：指参考的琼脂稀释法为敏感，而此法则为耐
7、药者。“小错误”：指两法之间有差异的。结论是 E 试验和琼脂筛查试验适合检出全部的 VRE（包括 Van C1/C2）。Jorgensen 等也推荐万古霉素筛查法，培基应用脑心浸液（BHI）含 6g/ml 万古霉素，细菌接种量应为 105 或 106CFU，可以点种，也可用0.5McFarland 药液以棉拭涂布，任何生长的肠球菌均判为 VRE，此法可检出 Van A、B、C 的基因型。Rohner 等比较 6 种方法检测耐万古霉素的类型。（1）琼脂筛查法分别用 BHI 和 MH 培基。（2）肉汤稀释法分别用 BHI 肉汤和调正离子的 MH肉汤（CAMUB ）。（3）琼脂稀释法分别用 BHI
8、和 MH 培基。（4）E 试验分别用 BHI 和 MH 琼脂。（5）纸片扩散法分别应用 BHI 和 MH 琼脂。（6）自动仪器法用 Vitek 仪器、 GPS-SA 卡片和 Ro2.03 软件分析。经比较 100 株肠球菌包括 34 株尿肠球菌、43 株粪肠球菌、11 株鸡肠球菌、10 株Casscliflavus/flavescer（菜黄/黄色），1 株鸡肠球菌、1 株鼠李糖球菌，参考菌株用屎链球菌 ATCC29212，ATCC51299。比较结果最佳者为 应用 BHI 的肉汤稀释法，应用 BHI 的琼脂稀释法及 BHI 的 E 试验，判定时间均应用 24h，而 NCCLS 现规定应用 MH
9、 琼脂的纸片法或 MH 琼脂的筛查法均不完善。Sahm 等人则提倡筛查 VRE 时应用 SBA 琼脂（胰酶大豆汤加 5羊血）最好。3 多重 PCR 法检测 VRE 的基因型 多重 PCR 法 Dutka-Malen 等曾详细介绍该方法，可在 4h 内完成，Satake 等直接用肛内拭子取粪便提取 DNA，经纯化后进行多重 PCR，同时测 Van A、B、C1、 C2，应用四对引物，产物分别为 Van A732bp(1429bp)，特异性 99.6，Van B635bp，Van C1822bp，Van C2484bp(C2/C3439bp)。检出VRE 的基因型比较可用酶切（Sma）的 PFGE
10、 法分析，可多达 36 种电泳图形，用于流行菌株的确定。4 应用表型与分子生物学结合的方法 Sahm 建议的表型和分子生物学手段的流程如下： 5 万古霉素依赖性肠球菌（Vancomycin-Depemdent Enterococi，VIDE） 临床分离的细菌曾出现过吡多醛依赖性肠球菌、链霉素依赖性大肠杆菌、替考拉宁依赖性肠球菌、链霉素依赖性分支杆菌，现发现耐万古霉素的肠球菌（VER ）的突变株可形成 VDE，在粪、尿、鸟链球菌中均已出现。万古霉素耐药基因转移给其他革兰氏阳性球菌，如葡萄球菌的潜在可能性具有很大威胁，应引起临床细菌学工作者高度警惕。Fraimov 等首先报告自临床分离的 VDE，
11、系自尿中分离的含 VanB 基因的屎链球菌且经过长时间的万古霉素治疗。VDE 的生长需万古霉素或 D-丙氨酸-D-丙氨酸（ DADA），其机制与 DADA 连接酶基因突变有关，少数 VDE 可自然逆转为非依赖性，逆转频率为 110-6。文献中已报告有 6 例 VDE 的感染。所报告的 6 例均与长期抗菌治疗有关，且 4 例为肾病患者。作者 患者 临床分离株Fraimov H 等 长期住院者 尿、Van B 屎肠球菌Woosford N 等 二例肾疾患 粪、尿肠球菌Groen M 等 移植 血 Van B 粪肠球菌Rosato A 等 肾脓肿 粪 Van A 鸟肠球菌Dever L 等 看护院老
12、者 粪 Van B 粪肠球菌Sng 等 肾疾患 血 Van B 粪肠球菌培基表面加万古霉素纸片，如周围有肠链球菌生长，提示为 VDE，再进一步确定。其药敏试验需在培基中加入万古霉素，但会干扰结果的判定，故 Sng 等倡用 DADA，其浓度以 1000pg/mL 为佳。Sng 等发现用此法测 VDE 对多种抗生素的 MIC 在 24h 观察结果，除对万古霉素耐药外，均为敏感，这是因为 VDE 生长缓慢，在 48h 读取结果，则利福平、高浓度链霉素、quimpristin/dolfopri Stin 杀菌效果最佳。Sng 等用 PCR-RFLP 分析分析自患者分离的 VRE、VDE，其自然逆转株及患者的尸检株显示为同一菌株，充分肯定 VRE 已转变为 VDE。
