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1、水微生物学实验指导书武汉科技大学城市建设学院给排水工程系2007.121目录页实验一 光学显微镜的使用及微生物形态的观察活性污泥生物相的观察 实验二 培养基的制备及灭菌微生物的纯种分离及计数 实验三 微生物生理生化特性2实验一 光学显微镜的使用及微生物形态的观察一、实验目的1.了解普通光学显微镜的构造，学习显微镜的使用方法和保养方法。2.观察蓝细菌、霉菌、酵母菌、放线菌的个体形态，学会生物图的绘制。二. 实验内容 1显微镜的使用方法和保养方法2微生物形态的观察 三、实验仪器、设备及材料1.光学显微镜、载玻片、盖玻片等2.示范片：颤藻、曲霉、青霉、酵母菌、放线菌。四、实验原理显微镜的结构和各部分
2、的作用图 1 是微生物实验常用的双目电光源生物显微镜，其构造分机械和光学两部分：机械部分主要包括：1镜筒 镜筒是双筒，两筒间距离可调，长度一般是 160mm。它的上端装有接目镜，下端有回转板。回转板上一般装有 3 个接物镜。2载物台 载物台是放置标本的平台，中央有一圆孔，使下面的光线可以通过。两旁有弹簧夹，用以固定标本或载玻片。有的载物台上装有自动推物器。3调节器 镜臂旁有两个螺旋，大的叫粗调节器，小的叫细调节器，用以升降载物台，调节接物镜与所需观察的物体之间的距离。光学部分主要包括：1接目镜 一股使用的显微镜具有 23 种放大倍数的接目镜，其上常刻有“5”、 “10”或“16”等数字及符号。
3、意即使用时可放大 5 倍、10 倍或 16 倍。观察微生物时常用放大 10 倍或 16 倍的接目镜。2接物镜 接物镜装在回转板上可分低倍镜、高倍镜和油镜 3 种，其相应的放大倍数常是 10、40 (45)、100。通常显微镜的放大倍数等于接物镜与接目镜放大倍数的乘积。例如：用放大 40 倍的接物镜(高倍镜) 与放大 10 倍的接目镜时所得的物象的放大倍数为 4010400。如果用放大 100 倍的接物镜则放大倍数为100101000。接目镜装在镜筒上端，在使用过程中并不经常变动，所以通常所谓的用低倍镜、高倍镜或油镜的观察主要是指使用不同的接物镜而言的。油镜的放大倍数最大(100)。放大倍数这样
4、大的镜头，焦距就很短直径就很小。所以自标本玻片透过的光线，因介质密度(从玻片至空气，再进入油镜) 不同、有些光3线因折射或全反射，就不能进入镜头，致使射入的光线较少，物象显现不清。所以为了不使通过的光线有所损失，须在油镜与玻片中间加入和玻璃折射率(M1.52)相仿的镜油(香柏油 M1.5l5)。因为这种接物镜使用时须加镜油，所以我们称它为油镜。一般的低倍镜或高倍镜使用时不加油，所以也称之为干镜。3聚光器 聚光器在载物台的下面，用来集合由光源过来的光线。聚光器可以上下调整，中央装有光圈。用以调节光线的强弱。当光线过强时应缩小光圈或把聚光器向下移动。4光源 光源装在显微镜的最下方，带有开关，其光亮
5、也可调节。五、实验步骤(一)显微镜使用和保护的方法1低倍镜的使用法(1)置显微镜于固定的桌几上，接上电源，打开开关，调节合适光量。(2)拨动回转板，把低倍镜移到镜筒正下方，和镜筒连接而对直。(3) 两眼向接目镜里观察，同时调节两目镜镜筒间的距离，使两接目镜中的视野重合。 (4)把载玻片放到载物台上，要观察的标本放到园孔的正中央。(5)将粗调节器向上旋转，同时眼睛注视接物镜，以防接物镜和载玻片相碰。镜头的尖端距载玻片约 5mm 时即停止旋转。(6) 两眼向接目镜里观察，同时把粗调节器向下旋转。如标本显出，但不十分清楚，可用细调节器调节，至标本完全清晰为止。(7)假如因旋转粗调节器太快，致使超过焦
6、点，标本不能出现时，不应在眼睛注视接目镜的同时向上旋转粗调节器，必须从第(5)步作起，以防因没有把握的旋转，使接物镜与载玻片碰触，造成损坏。(8)在观察时，两眼都要同时睁开。2高倍镜的使用法(1)使用高倍镜以前，先用低倍镜检查，在用低倍镜找到观察目标后，若需要进一步放大观察，将目标移到视野中央。(2)拨动回转板使高倍和低倍两镜头互相对换。当高倍镜移动到载玻片时，往往镜头十分靠近载玻片。这时必须注意是否因高倍镜靠近的缘故而使载破片也随着移动。如果载玻片有移动的现象，则应立刻停止推动回转板。把高倍镜退回原处，再按照使用低倍镜的方法，重新校正标本的位置。用转换器将高倍镜移到镜筒下方，将光量调大一点。
7、图 24(3)当高倍镜已被推到镜筒下面时，向镜内观察所显现的标本，往往不很清楚，这时可旋转细调节器使之清晰，上下移动，但不要过分移动。 （此时不再动粗调）3油镜的使用法(1)如用高倍镜放大，倍数还不够大则须采用油镜。用油镜以前，先用低、高倍镜检查。把要观察的标本移到视野正中。(2)用油镜时，在载玻片标本上加几滴镜油，然后拨动回转板对换高倍镜和油镜，使油镜头尖端和油接触，而后向接目镜观察。假如不清晰，可稍微转动细调节器，但切记不要用粗调节器。(3)用过油镜后，必须用擦镜纸或软绸将载玻片和油镜所粘着的油拭净，略蘸擦镜液少许，揩拭镜头，最后用擦镜纸或软绸擦干。4显微镜的保护法(1) 显微镜应放置在干
8、燥的地方，使用时须避免强烈的日光照射。(2) 将载物台降至最低，取下标本片。将光量调至最小，关上电源。(3) 接物镜或接目镜不清洁时，应当用擦镜纸或软绸揩擦。(4) 用完显微镜后，应当立即放到镜匣中。（二）微生物形态的观察1. 用低倍镜和高倍镜观察颤藻、曲霉、青霉、酵母菌、放线菌、星藻示范片。2. 画出微生物形态图，并标明显微镜的放大倍数及微生物的名称。六、实验报告要求1分别绘出你在低倍镜、高倍镜、油镜下观察到的颤藻、曲霉、青霉、酵母菌、放线菌等的形态，包括在三种情况下视野中的变化，同时注明物镜放大倍数和总放大倍数。2做思考题（详见八、思考题）七、实验注意事项1取放显微镜时应一手握住镜臂，一手
9、托住底座，使显微镜保持直立、平稳。切忌用单手拎提；使用显微镜时应双眼同时睁开观察，以减少眼睛疲劳，也便于边观察边绘图或记录。2在任何时候使用粗调节器聚焦物像时，必需养成先从侧面注视小心调节物镜靠近标本，然后用目镜观察，慢慢调节物镜离开标本进行准焦的习惯，以免因一时的误操作而损坏镜头及玻片。3切忌用手或其它纸擦拭镜头，以免使镜头沾上污渍或产生划痕，影响观察。八、思考题51使用显微镜时，哪些地方须特别注意?2使用低倍镜时，显微镜的放大倍数一般最大可达多少?使用高倍镜时显微镜的放大倍数是怎样呢? 在什么时候才需要使用油镜?活性污泥生物相及藻类形态的观察一、 实验目的1.学习测量微生物大小。2.学习用
10、压滴法制作标本片。3.观察几种原、后生动物，菌胶团及藻类个体形态二、 实验内容1. 目测微尺和物测微尺及其使用的方法2标本的制备3显微镜观察三、实验仪器、设备及材料1. 活性污泥混合液。2. 单胞藻、新月藻、草履虫等示范片。3. 显微镜、载玻片、盖玻片。4. 目测微尺、物测微尺。四、实验原理1目测微尺 目测微尺是一圆形玻片，其中央刻有精确的刻度(图 3)，等分为 100 格或更多格。标尺刻度的大小，随使用的接目镜和接物镜放大倍数以及镜筒的长度而改变。2物测微尺 物测微尺系一厚玻片，中央有一微小圆圈，圆圈里有 100 等分刻度标尺，每等分的长度为 1100mm，即 10m 格。五、实验步骤1.目
11、测微尺和物测微尺的使用方法目测微尺 使用前，应先利用物测微尺进行标定。物测微尺 目镜测微尺图 3物测微尺6使用时，先将目测微尺装入接目镜的隔板上，使刻度朝下；把物测微尺放在载物台上，使刻度朝上，用平常观察标本的方法，先用低倍镜找到物测微尺的刻度，再移动物测微尺与目测微尺使两者的第一线相合，然后计算物测微尺的每一小格内有目测微尺的小格若干个，于是计算后者刻度所表示的长度。如物测微尺的一小格相当于 5 个目测微尺的小格，则目测微尺在此种条件下，其每格的长度即等于2m。如在同样条件下测量物体，而物体之长度为目测微尺的两小格，宽为半小格，则可知此物体的大小为 1m 4 m。换高倍镜用同样方法标定出高倍
12、镜下目测微尺每格的长度。2标本的制备1)取活性污泥法曝气池混合液一小滴，放在洁净的载玻片的中央( 如混合液中污泥较少，可待其沉淀后，取沉淀污泥一小滴于载破片上；如混合液中污泥较多则应稀释后进行观察)。2)小心地用洗净的盖玻片覆盖。这样，就制成了活性污泥的标本。加盖玻片时应使其中央已接触到水滴后才放下，否则会在片内形成气泡而影响观察。3显微镜观察(1)低倍镜观察1)在选定的接目镜下，利用低倍镜，确定目测微尺一格的长度( 单位以 m 计) 。2)观察所制备的微生物标本玻片，画出所见原生动物、菌胶团等微生物的形态草图。选择一个原生动物，量出其尺寸。3)记下观察所用接目镜和接物镜的放大倍数，算出显微镜
13、的放大倍数。(2)高倍镜观察1)改用高倍镜观察，利用高倍镜，确定目测微尺一格的长度( 单位以 m 计) 。画出微生物的形态草图并与用低倍镜所看到的比较，注意其不同点。2)记下显微镜的放大倍数。3)观察几种藻类的个体形态，画出生物形态图，标明名称、放大倍数。六、实验报告要求1描述所见藻类、原生动物、菌胶团等微生物的形态特征，画出草图。选择一个原生动物，量出其尺寸。2做思考题（详见八、思考题）七、实验注意事项1观察时光线不宜过强，否则难以找到镜台微尺的刻度；换高倍镜和油镜校正时，务必十分小心，防止接物镜压坏镜台微尺和损坏镜台。八、思考题1为什么目测微尺必须用物测微尺标定? 在某一放大倍数下，标定了
14、目测微尺，7如果放大倍数改变，它还需重新标定否?实验二 培养基的制备及灭菌本次实验可为下次实验作准备。实验内容主要包括玻璃器皿的洗刷、包装和培养基的制备以及灭菌技术等。在作微生物学实验时，所用培养基及玻璃器皿等均须进行灭菌。一. 目的1学会玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备工作。2掌握培养基配制和无菌水制备的方法。3. 学会干热灭菌和高压蒸汽灭菌技术。二. 实验器材1.培养皿、试管、吸管、锥形瓶等。2.牛皮纸等包扎材料。3. 10% HCl、10% NaOH、精密 pH 试纸。4. 牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂。5. 高压蒸汽灭菌锅等。三、实验内容(一)玻璃器皿的洗刷与包装1洗刷 玻璃器皿在使用前
15、必须洗刷干净。培养皿、试管、锥形瓶等可以用去污粉或肥皂洗刷，然后用自来水冲洗。吸管则先用洗液浸泡，再用水冲洗。洗刷干净的玻璃器皿应放在烘箱里烘干。2包装(1) 培养皿由一底一盖组成一套。按实验所需的套数一起用牛皮纸包装。(2) 吸管应在吸端用铁丝塞入少许棉花，构成 11.5cm 长的棉塞。以防止细菌吸入口中，并避免将口中细菌吹入管内。棉花要塞得松紧适宜。吸时既能通气，又不致使棉花滑入管内。将塞好棉花的吸管的尖端。放在 45cm 宽的长纸条的一端，吸管与纸条约成 350 交角，折叠包装纸包住尖端，用左手将吸管压紧，在桌面上向前搓转，纸条即螺旋式地包在管子外面，余下纸头折叠打结，按照实验需要，可单
16、支包装或多支包装，以备灭菌。3. 干热灭菌上述玻璃器皿在 160烘箱内加热 2 小时。(二)培养基的制备营养琼脂培养基(肉膏、蛋白胨、琼脂培养基 )是一种固体培养基。本实验制备后可供活性污泥纯种分离和细菌总数测定之用。81. 细菌培养基成分牛肉膏 蛋白胨 氯化钠 琼脂 自来水0.75g 2.0g 1.0g 4.0g 200ml2. 步骤(1)配制溶液 按培养基的配方，称取各种原料。取适量的烧杯盛所需水量，依次将各种原料加入、溶解。难溶的原料如蛋白胨、牛肉膏、琼脂等需加热溶解。这时，当原料全部溶解后应加水补充因蒸发损失的水量。加热时应不断搅拌以防原料在杯底烧焦。(2)调整 pH 值 用精密 PH 试纸(或 pH 电位汁或氢离子浓度比色计)测定培养基溶液的 pH 值。按要求
