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1、菠菜叶绿素的分离四、实验内容及步骤 1样品制备菠菜叶绿素的提取 12 片新鲜的菠菜叶剪碎放于研钵中研磨，然后加入20mL 石油醚-乙醇（1：1）混合液继续研磨 3 分钟 1。用移液管或滴定管将萃取液移至分液漏斗中 2，加等体积水洗涤 3（旋摇几下，但不可振荡以防产生乳化） ，分层，弃取下层水层，再加等体积水洗涤，弃取水层，将上层溶液移至干燥的小锥形瓶中，用无水硫酸镁干燥，备用。下一步 2制板在小烧杯中放入 2g 硅胶，加入 50mL0.5羧甲基纤维素钠水溶液，调成糊状，均匀倒在 3 块干净的载玻片上 4（2.5cm 7.5cm）,用玻璃棒刮平，轻轻振摇，使硅胶均匀铺在载玻片上且表面光滑均匀。于
2、室温下放置 15 分钟，晾干。然后放入烘箱在 105110活化 0.5 小时。下一步 3分离与鉴定在活化的薄层板一端约 11.5cm 处，用铅笔轻轻划一条直线作为起点线（不要划破吸附剂层）或在薄层板边缘作一记号。用管口平整的毛细管吸取菠菜叶绿素提取液点样，斑点直径约为 23mm。溶剂挥发后，将点样一端放入已放有高约0.5cm 展开剂的展开槽中 5（展开剂为丙酮：石油醚=1：2） ，盖好盖，观察展开过程，当展开剂沿上行到距薄层板另一端约 1cm 时，立即取出，并立刻用铅笔划出展开剂前沿的位置。晾干后，仔细量下每个斑点所走的距离，计算 Rf 值。附注 1只需适当研磨，不可研得太烂而成糊状，否则会造
3、成分离困难。 2也可用小布氏漏斗过滤，稍稍减压并用瓶子挤压固体。 3水洗的目的是洗涤乙醇及提取液中的少量水溶物。 4载玻片必须洗净，并用少量丙酮或乙醚擦拭。 5展开槽加入溶剂后，可轻轻摇动几下，使之充满溶剂蒸汽。三、实验仪器及试剂仪器：载玻片；展开槽；玻璃棒；研钵试剂：硅胶 G；95乙醇；石油醚（6090）；丙酮；菠菜叶实验 7. 薄层层析（甲基橙与荧光黄）实验目的要求:了解薄层层析的原理，操作和应用。实验内容：色素的薄层层析：1、硅胶薄层板的制备取洁净干燥的玻片数块，放在水平桌面上备用，称取硅胶 H10 克及 40ml 水，置于乳钵中研匀，用牛角勺涂布在玻片上，用手指抬起玻片一端，连续在桌面
4、上轻轻拍打，使形成一均匀薄层，平放在水平玻板上，让水分自然蒸发，晾干备用。2、配展开剂：用吸量管准确量取氯仿 2.00ml，甲醇 0.50ml 于洁净干燥的层析筒中，摇匀、密闭备用。3、点样：硅胶-H 薄层板一块，用管口平整的毛细管将甲基橙、荧光黄及两者混合乙醇液分别点在起始线的三个原点上，斑点扩散直径不应超过 23mm，放置片刻待乙醇挥干。4、展开：将点好样品的硅胶层析板放入盛有展开剂的层析筒中，（注意：切勿将点样处浸没于展开剂中进行密闭展开。）（如图）当展开剂前沿扩散到距顶端 1 厘米左右时，取出薄层板，立即用大头针划出溶剂前沿，然后置薄层板于通风处挥干展开剂。5、计算 Rf 值：用直尺分
5、别量出原点到斑点中心的距离和原点到展开剂前沿的距离，分别计算出：甲基橙、荧光黄，混合样品的 Rf 值，用混合样品的两个 Rf 值与对照品甲基橙、荧光黄比较鉴定混合样品。实验十四 薄层色谱法（亚甲基蓝荧光黄的分离）一、目的要求1 学习薄层色谱法的原理；2 掌握薄层色谱法的操作。二、基本原理薄层色谱法也叫薄层层析法。它的特点是把吸附剂均匀地铺在一块玻璃板上，铺成薄薄的一层，一般以 0.51 毫米厚为宜。然后在这薄层上点好样品，将这点了样品的薄板放在盛有一定展开剂的层析缸中，层析就在这薄层上进行，故称为薄层层析法。层析法是一种有效的分离方法，它是将待分离的混合样品置于某种吸附剂（固定相）上然后让一溶
6、剂（流动相）通过。由于混合样品中各组分在吸附剂和溶剂中的吸附、溶解能力不同即在两相中的分配不同，所以各组分在固定相上随溶剂移动的速度不同，从而达到分离的目的。薄层层析法具有操作简便，灵敏度高等优点，因此广泛应用于物质的鉴定、分离和提纯。有色物质的样品，在薄板上展开后可直接观察到它们的分离情况。但无色物质的样品，在薄层上展开以后，需要通过显色才能观察到它们的分离情况。显色方法可在薄板上喷显色剂或把薄板放入密闭缸中用显色剂熏蒸，而显出有色斑点。对一些荧光物质样品，可在紫外光下照射来观察分离情况。三、仪器和试剂 1仪器：载玻片 10 毫升量筒 50 毫升烧杯 250 毫升烧杯 表面皿 研钵2试剂硅胶
7、 G(200400 目) 、0.5CMC 水溶液(羧甲基纤维素钠水溶液 )0.1亚甲基蓝水溶液、0.1 %荧光黄乙醇溶液、未知液四实验步骤：1薄板的制备称取 3 克硅胶 G，加 0.5CMC 水溶液 7 毫升，立即调成糊状。用拇指和食指拿玻片一端的边缘，稍倾斜，将调好的糊状硅胶 G 倒在两块载玻片上，须让其斜面充满玻片表面，然后将手指轻轻振摇，目的是使表面均匀光滑，平置于桌上晾干后，放置烘箱内活化 (105110 )30 分钟，取出后放入干燥器内保存使用。1 点样：用刀刮去薄层板左右两边的硅胶(因有边缘溶剂效应) ，距薄板底边 1 厘米处划上起始线，在起始线上，用铅笔轻轻点两点，两点间的距离为
8、 1 厘米，在另一端距顶边 0.5厘米处画上前沿线，用毛细管（内径小于 1 毫米）分别吸取标准液和未知液垂直地轻轻接触到薄层的起始线上，如图 3-30 所示。两点之间的距离为 1 厘米，样品斑点的直径要控制在 23 毫米，为此毛细管的未端要平整，如溶液太稀，一次点样不够，第一次点样干后，再点第二、第三次，每次都要点在同一位置上，点的次数依样品溶液浓度而定，一般为25 次，若样品量太少时，有的成分不易显出，若量太多时易造成斑点过大，互相交叉或拖尾，不能得到很好的分离。点样时，使毛细管液面刚好接触薄层即可。切勿点样过重而使薄层破坏。2 展开：在层析缸（可用 250 毫升烧杯）中加展开剂（95乙醇：
9、水=1：1）约 5 毫升（高度不能超过 1 厘米） ，如图 322 所示。盖上玻盖（薄层色谱需要在密闭容器中进行） ，静置一段时间，使杯内溶剂蒸汽达到饱和，然后将点好样品的薄层板斜放在层析缸内，起始线必须在展开剂液面之上。当展开剂上升到溶剂前沿线时各组分已明显分开时，取出薄板放平晾干。3 求比移值(Rf 值)： 在固定的条件下，不同的化合物在薄层上移动的距离不同，当吸附剂、溶剂、展开剂及温度等层析条件相同时，Rf 值是一个特有的常数，可作定性分析的依据。将纯样品和未知液样品的 Rf 值进行对照，鉴定未知液。思考题：1在一定操作条件下，为什么可利用 Rf 值来鉴定化合物?2在混合物薄层色谱中，如
10、何判定各组分在薄层上的位置?3展开剂的高度若超过了起始线，对薄层色谱有何影响?4荧光黄和亚甲基兰哪个爬行的速度快?为什么附注：1 在制取薄层板中最常用的固态吸附剂是硅胶(SiO 2H2O)常含有粘合剂（CaSO 4H2O） ，以保证硅胶能粘在玻璃表面上，含有粘合剂的称为硅胶 H，含有荧光物质的称为硅胶 GF254（可在波长 250nm 紫外光下观察荧光） ，含粘合剂和荧光剂的称为硅胶 GF254 也可用氧化铝制板。2 硅胶是缩水硅酸（SiO 2H2O） ，中加热脱水过程中形成多孔性的硅氧交链结构的物质(Si OSi 一 )其表面含有硅醇(OHSiOH) 基，它对极性化合物具有吸附能力，同时也能
11、吸附多量的水分，而硅胶的含水量关系到它的活性，含水量大，活性低，因此要加热除去水分来提高它的吸附能力，这一过程称为薄板的活化。图 3-30 薄板的点样图 3-31 层析展开3 薄层板制备的好环是薄层色谱法成败的关键，为此，薄层必须尽量均匀且厚度 (0.251 毫米) 要一致，否则，在展开时溶剂前沿不齐，色谱结果也不易重复。仪器与试剂双槽层析缸 玻璃板 1020 cm（厚 3mm） 毛细管 0.5mm 研钵电吹风 天平（0.1mg）硅胶 G（薄层层析用） 生药当归、丹参层开剂：正已烷：乙酸乙酯（：）硅胶 G 薄层板的制备：称取硅胶 G 10g 和 0.5%的羧甲基纤维素钠溶液 30ml 在研钵中
12、向一方向研磨混匀，去除表面的气泡后，在玻璃板上平稳移动进行涂布铺好后于室温下，置水平台上晾干，在反射光和透射光下检视，表面应均匀，平整，无麻点，无气泡，无损坏及污染，于 110烘 30min,冷却后立即使用或置于干燥箱中备用。硅胶G薄层板的制备（已完成）样品的制备点样用毛细管吸取上述二种溶液各10 l，分别点于同一硅胶G薄层板上。1.点样一般为圆点，点样基线距底边cm2.点样直径一般不大于2mm3.点间距离大于0.8cm 4.点样时必须注意勿损伤薄层表面。展开点好样的薄层板放入展开缸的展开剂中，以正已烷：乙酸乙酯（9:1）20ml为展开剂，浸入展开剂的深度为距原点5mm为宜，密封，待展开至6-8cm,取出薄层板，晾干，用电吹风热风吹薄层板，至有斑点出现当归、丹参各2g，分别加10ml乙醇，置于50ml锥形瓶中超声振荡10分钟，取上清液
