英文用聚合酶链反应方法自动测序dna文章翻译

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1、用聚合酶链反应方法自动测序 DNA聚合酶链反应（PCR） ，为一种通过制备 DNA 模板来进行测序被用于的反应。原位程序直接测序 PCR 的产物通过双脱氧终止法是使用荧光团标记的测序引物发展的。合并序列反应液后，装入单个含有荧光的电泳泳道的序列分析仪中。DNA 的目标缺乏一个在通用标记测序引物中掺入一个通用初级序列到 PCR产物中的初级序列。用这种方法， 噬菌体的基因组区域中一个 351 个碱基对的序列在电泳通道中的准确性 99。长 1700 个碱基对的未知序列，通过此过程测序， “PCR 基因扩增”的策略相结合。1110 个碱基组成的两条链的重叠区域只有两个单碱基发生错配。可以用自动化的 D

2、NA 序列高度多态性 HLA-DQA-1（阿尔法）在人类基因组区域执行这种简单的方法进行分析。分离提取个人在一个月时的血液样本中的 DNA，使用该 PCR 测序方法来模拟以明确基因型。DNA 出现双脱氧终止法的测序（1）鼓励科学家设计出合理策略，以应对大型测序项目。 （2）显然，对于未来，AU-缩混高通量方法的开发是一个合理的焦点。为了实现这一目标，自动 DNA 序列分析已经通过组合基于荧光的检测用脱氧终止实现。 （3）其他方面克隆测序项目，制备模板和测序运行重新动作。然而，复杂的人工操作还需要劳动力和技能。此外，操作类型需要为这些手工方法的模板的类型，因此，缺乏重复性性质有利于自动化操作。聚

3、合酶链反应（PCR） ，在体外 DNA 上午 plification 方案（4） 。已经被提出作为一种技术来制备自动 DNA 测序前模板（5,6） 。之前自动化 PCR 过程一直是半自动化很大程度上是凭借其周期性，包括（a）变性。 PCR 过程一直半自动化很大程度上是由凭借其周期性，组成的 DNA 模板（95C ）所示，核糖核酸引物（b）杂交引物变性的模板（50C）中， （c）模板的复制（70C ）催化 Thermu.s 水生的 DNA 聚合酶（Taq 聚合酶） 。在 PCR 技术中我们已结合DNA 模板制备与用于自动 DNA 序列分析的基于荧光的方法（3,7）的 DNA 测序项目的多级自动更

4、充分。材料和方法仪器与试剂对于热循环我们使用 DNA 热循环仪（Perkin-Elmer 公司，康涅狄格州 Norwalk06859） ，一般根据以下循环：502分钟，702 分钟 20 秒，和 94，1 分钟。用于 DNA 扩增，我们只用 DNA 扩增试剂盒的“基因扩增”生化试剂，其中包括 10缓冲液，脱氧核苷三磷酸，和从水生生物中提取的 Taq 聚合酶（Perkin-Elmer 公司中分离鲸鱼座，诺瓦克，CT06859） 。轻质矿物油是从 Sigma 公司（圣路易斯，密苏里州 63178 追逐;cat.no. N-23516）购买;0.5 毫升无菌管从罗宾斯科学购买（山景，CA 94043

5、） 。基于荧光的 DNA 序列分析是用 370A DNA 测序仪（生命科技公司，福斯特城，加利福尼亚州 94404，装配有 6的聚丙烯酰胺凝胶，并与制造商的运行 1.3 版本软件。聚丙烯酰胺凝胶制备的玻璃板从 ABI 购买。修改的 T-DNA 7 聚聚合酶（“测序酶”第 1 版，目录号 0700）和终全国核苷酸混合物（cat。NO70714，70716，70718，70720）从美国购买（克利夫兰，OH 44122） 。测序酶（20 单位）稀释在含有 50mmol 二硫苏糖醇的，3.8mmol 水中，和 0.38毫摩尔/l 的 EDTA。冻干序列引物（-21 M13 和 M13 反向，标有四个

6、荧光，FAM， ROX，JOE 和 TMRA）为从 ABI 购买（8） 。每个荧光标记通过将引物溶于 10mmo1 / L 的 Tris 缓冲液（pH8.0）中，含有 1.0mmol/ml 的 EDTA，得到0.8pmol/l 的终浓度，并是在20 保存。从全血浆提取 DNA 使用 ABI340A 核酸提取（根据 ABI 用户公告。14，十月，1987） 。人类 DNA 的 1.7 kb 的片段克隆到 pGEM 捐赠勿博士克雷格文特尔（NA-卫生，贝塞斯达，MD20892 tional 研究院） 。 我们合成脱氧寡核苷酸勿将 phosphora-midite 方法（9） ，用 381A DNA

7、 合成仪（ABN0.2 ，摩尔规模（0.2 皮摩尔周期，vereion1.23 软件;ABI 用户公告没有。 7，八月，1986）与（2-O-氰基乙基） -phosphoramidites（ABN。寡核苷酸的纯化化墨盒从 ABI 购买。紫外吸收光谱，我们使用一个 8451A 二极管阵列分光光度计（惠普，帕洛阿奥拓，CA94304） 。程序制备 PCR 引物，溶于氨水在 57孵化 20 小时，有一半的引物（1.5 毫升中 NHG）通过寡核苷酸净化筒富集如别处所述（10） 。 （图 1：101-109，L11,112，和 114） ，制备蒸发至干的富集产物，收集溶解在 1mL 去离子水中的引物溶液

8、（约 5） 。我们用分光光度法确定浓度，A 假设在 260 的吸光度处指示为 1.0，含有 33wg 的 DNA。最终浓度为在 0.5 和 1.0 umol/之间。过量收集制备同样的引物（图 1：101，102，110，和 113） ，得到最终浓度在 20 和 50 umol 之间。我们修改了上述人类基因组 DNA 的扩增程序。应用两步骤我们扩增的HLA-DQA-1 基因（11） ，以单链的形式同时包含了一个通用引物序列（图 3）如下：浆 2 ul 的纯 DNA 溶解在 10ul 去离子中并添加 100ul 该基因组 DNA 溶液的 PCR 缓冲液（1反应缓冲液） ，包括 0.02 纳摩尔每个

9、核糖核酸的，5.0 皮摩尔的 PCR 引物 112 和 20 皮摩尔的 PCR 引物 11。在 95，加热 3 分钟，之后将样品经受 30 次热循环（55，2 分钟;72，1 分钟 ;94，1 分） ，转移1.0mmol 水相，含有 3.0umol/ml114PCR 引物，50pmol 引物 113，20 个循环（50，2 分钟;72，1.5 分钟+3 秒;96，45 秒） ，将所得水相物保存在-20。DNA 测序。对于 DNA 测序反应我们增加了 3ul 到 PCR 溶液，1.5ul 有0.4pmol 的标记溶液（FAM ）-21 M13 引物和最终序列缓冲液（ 10 mmol / L 的t

10、ris-HCl 缓冲液，pH 值 8.5，10mmol/l 的 MgCl2 和 50mmolNaCl ） 。在 90孵化 5 分钟后,在冰上冷却 2 分钟，轻轻离心，并加入 2ul 脱氧核糖-5-三磷酸混合物和 1.5ul 反应混合液，该混合液在 37孵育 5 分钟，然后 65加热 10 分钟。在适当的温度下将反应混合物手动转移到模块中。其他三个测序反应亦同时进行的（与 TMRA，乔，ROX),脱氧核糖核酸和核糖核酸需要 2 倍的成分。4个测序反应冷却至 4，用乙醇和 6ul 甲酰胺/ EDTA 悬浮，50mmol/ L 的（5/1体积比） ，并进行凝胶电泳。结果与讨论DNA 测序的双脱氧终止

11、法是普遍接受，作为一种单链模板比双链更有效果的方法。因此，我们发明了一个基于荧光的测序方法。使用由不对称单链 DNA产生的扩增（12） 。利用不平等摩尔量的两种扩增引物，它是可能产生过量的单链 DNA 的选择链的直接测序。我们推出了插入 PCR 产物的单向通用引物序列（图 2）通过使用的引物的浓度（111）包含-21 M13 通用序列（14） 。这个顺序包括定量的方法使我们能够使用市售的通用荧光引物序列检测 DNA 序列，由于最初缺乏通用序列。四等分 PCR 溶液（各 3ul 用于测序的引物，标有荧光素衍生物 FAM 和 JOE，和 6ul 分别用于衍生罗丹明引物推导（表 3-6 TMRA 和

12、ROX）直接加入测序反应，不用纯化。在同一个自动序列分析仪检测下， 细菌的 351 个碱基对的 PCR 引物之间的准确率99 （图 4） 。我们应用这个排序的过程，而不同修饰离子（例如使用的不同的 PCR 引物等）以未知 1.7-kb 的序列插入 GEM 质粒（图 5） 。两条链扩增不对称。这些扩增用两个正向（101）和反向（102）的通用的 M13 引物（图 1）在任何一个50:1 或 1:50 比率。执行后，扩增，测序我们 PCR 产物使用：适当标记荧光的通用测序引物。用所得的各个序列信息链来合成两种新的 PCR 引物，从两端插入每个大约有 300bp。这些新的引物，103 和 106，合

13、成为包含一个显示两个的通用引物序列，并用于 M13 引物的第二轮扩增与通用（ 102 和 101，分别地） 。这些然后用适当标记的单向测序 PCR 产物。第二轮 PCR 测序，得到的序列信息增加 300 个碱基，是我们的“PCR 基因行走”方法的第二个“台阶” 。重叠的序列信息三方共计 L100 基地是经过四个步骤沿各股获得：图 6） 。在此只有两个单碱基对的位置 L100 区域不能被两条链的分析数据确定。这种基因步行方法不需要一步一步的程序或合成的替代 PCR 引物。显著引物对引物变异性在传统的基因步行方法是可现的，大概产生于二次引发位点。这个 PCR 基因步行方法中引诱定做 PCR 引物的

14、二次引发位点，没有显干扰的DNA 测序描述。然而，基因行走与原位策略一样受到限制：相对小的插入物（2 KB）中扩增取源于可以产生模板的数量和纯度。反转 PCR（13,14）允许大于 1.7 kb 的未知 DNA 片段序列，这种未知的反转录方法仅需要一种引物序列，当线性 DNA 被分离，溶解和母与 DNA 连接酶，目标产物用凝胶电泳分离。 产品允许的“感觉”和“反义”将用于扩增。倒反转录 PCR 允许大的 DNA 片段测序，例如，1000 个碱基的片段，这将降低整个克隆数量，克隆排序，并且克隆片段的分析。这些方法的实现可依赖自动化方法聚合酶链反应，制备凝胶电泳，分析自动 DNA 序列，通过一个液

15、体处理机器人来执行，除其他东西外，还有限制性内切酶消化和连接反应。此自动化的策略将大大减少，甚至消除需要克隆许多的序列模板。我们在这里开发的上面所述 PCR 序列过程的原位过程（6,6 将是对大多数测序项目有吸引力的工程，通过其潜在的自动化性。在 PCR 放大（样品制备）和测序手动的步骤基本反应减少到处理小体积，1-10ul ，可以委托给商用机器人（16） 。自动化快速的 DNA 测序策略在促进人类在医学区域内研究基因组有重要应用（17,18） 。这些测序应用程序在鉴别单核苷酸相对于正常的 DNA，在这两个纯合子和杂合子序列（18）提供了必要的快速和可靠的检测。图 7 示表示这种类型的自动化的

16、一个例子，在高度多态性 I3LA-配合的测序能力 林-1 人类基因组内的基因座。我们开始分析对于 HLA-DQA-1 区域 120 个碱基的序列，从血液中提取 2ul 的基因组 DNA，已经贮存一个月。两步 PCR 扩增方法被应用（15） ， HLA-DQA-1 区域在图 7 所示，对重叠的对标志由两个问号平峰 consis-帐篷核苷酸位置报道为多态 12） 。鉴于这种测序，这独立的随后被分配 A1.2 / A1.3 基因型（12） 。我们的观察这些多态性核苷酸位点产生近等效峰值强度说明了我们的能够为标志自动 1:1 混合物等位基因与使用荧光序列分析。这种类型的自动分析系统可以应用遗传性疾病的研究，以及 DNA 指纹判断。我们选择了这两步 PCR 方法对人类 DNA 主要是为了减少在扩展那个过程中第二次 PCR 的形成，在原位 DNA 测序中不需要的 PCR 产品可能会产生不必要的信号，测序之前单链 PCR 产物的凝胶纯化是非常有必要的。这两步 PCR的方式