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1、- 1 -第 1 节 微生物的培养与应用微生物培养基的配制原则目的明确配制培养基首先要明确培养目的，要培养什么微生物？是为了得到菌体还是代谢产物？是用于实验室还是发酵生产？根据不同的目的，配制不同的培养基。培养细菌、放线菌、酵母菌、霉菌所需要的培养基是不同的。在实验室中常用牛肉膏蛋白胨培养基培养异养细菌，培养特殊类型的微生物还需特殊的培养基。自养型微生物有较强的合成能力，所以培养自养型微生物的培养基完全由简单的无机物组成。异养型微生物的合成能力较弱，所以培养基中至少要有一种有机物，通常是葡萄糖。有的异养型微生物需要多种生长因子，因此常采用天然有机物为其提供所需的生长因子。如果为了获得菌体或作种
2、子培养基用，一般来说，培养基的营养成分宜丰富些，特别是氮源含量应高些，以利于微生物的生长与繁殖。如果为了获得代谢产物或用作发酵培养基，则所含氮源宜低些，以使微生物生长不致过旺而有利于代谢产物的积累。在有些代谢产物的生产中还要加入作为它们组成部分的元素或前体物质，如生产维生素 B12 时要加入钴盐，在金霉素生产中要加入氯化物，生产苄青霉素时要加入其前体物质苯乙酸。营养协调养基应含有维持微生物最适生长所必须的一切营养物质。但更为重要的是，营养物质的浓度与配比要合适。营养物质浓度过低不能满足其生长的需要；过高又抑制其生长。例如，适量的蔗糖是异养型微生物的良好碳源和能源，但高浓度的蔗糖则抑制微生物生长
3、。金属离子是微生物生长所不可缺少的矿质养分，但浓度过大，特别是重金属离子，反而抑制其生长，甚至产生杀菌作用。各营养物质之间的配比，特别是碳氮比（CN 比）直接影响微生物的生长繁殖和代谢产物的积累。CN 比一般指培养基中元素碳和元素氮的比值，有时也指培养基中还原糖与粗蛋白的含量之比。不同的微生物要求不同的 CN 比。如细菌和酵母菌培养基中的 CN 比约为51，霉菌培养基中的 CN 比约为 10l。在微生物发酵生产中，CN 比直接影响发酵产量，如谷氨酸发酵中需要较多的氮作为合成谷氨酸的氮源，若培养基 CN 比为 41，则菌体大量繁殖，谷氨酸积累少；若培养基 CN 比为 31，则菌体繁殖受抑制，谷氨
4、酸产量增加。此外，还须注意培养基中无机盐的量以及它们之间的平衡；生长因子的添加也要注意比例适当，以保证微生物对各生长因子的平衡吸收。理化适宜微生物的生长与培养基的 pH 值、氧化还原电位、渗透压等理化因素关系密切。配制培养基应将这些因素控制在适宜的范围内。1. pH 值各大类微生物一般都有其生长适宜的 pH 范围。如细菌为 7.08.0，放线菌为7.58.5，酵母菌为 3.86.0，霉菌为 4.05.8，藻类为 6.07.0，原生动物为6.08.0。但对于某一具体的微生物菌种来说，其生长的最适 pH 范围常会大大突破上述界限，其中一些嗜极菌更为突出。- 2 -微生物在生长、代谢过程中，会产生改
5、变培养基 pH 的代谢产物，若不及时控制，就会抑制甚至杀死其自身。因此，在设计此类培养基时，要考虑培养基成分对 pH 的调节能力。这种通过培养基内在成分所起的调节作用，可称为 pH 的内源调节。内源调节主要有 2 种方式：借磷酸缓冲液进行调节：例如调节 K2HP04 和 KH2P04 两者浓度比即可获得 pH6.47.2 间的一系列稳定的 pH，当两者为等摩尔浓度比时，溶液的 pH 值可稳定在 6.8。以 CaCO3 作“备用碱”进行调节：CaCO3 在水溶液中溶解度很低，故将它加入至液体或固体培养基中并不会提高培养基的 pH，但当微生物生长过程中不断产酸时，却可以溶解 CaCO3，从而发挥其
6、调节培养基 pH 的作用。如果不希望培养基有沉淀，有时可添加NaHCO3。与内源调节相对应的是外源调节，这是一类按实际需要不断从外界流加酸或碱液，以调整培养液 pH 值的方法。2. 氧化还原电位各种微生物对培养基的氧化还原电位要求不同。一般好氧微生物生长的 Eh(氧化还原势)值为 + 0.3+ 0.4 V，厌氧微生物只能生长在+ 0.1 V 以下的环境中。好氧微生物必须保证氧的供应，这在大规模发酵生产中尤为重要，需要采用专门的通气措施。厌氧微生物则必须除去氧，因为氧对它们有害。所以，在配制这类微生物的培养基时，常加入适量的还原剂以降低氧化还原电位。常用的还原剂有巯基乙酸、半胱氨酸、硫化钠、抗坏
7、血酸、铁屑等。也可以用其他理化手段除去氧。发酵生产上常采用深层静置发酵法创造厌氧条件。3. 渗透压和水活度多数微生物能忍受渗透压较大幅度的变化。培养基中营养物质的浓度过大，会使渗透压太高，使细胞发生质壁分离，抑制微生物的生长。低渗溶液则使细胞吸水膨胀，易破裂。配制培养基时要注意渗透压的大小，要掌握好营养物质的浓度。常在培养基中加入适量的 NaCl以提高渗透压。在实际应用中，常用水活度表示微生物可利用的游离水的含水量。经济节约配制培养基特别是大规模生产用的培养基时还应遵循经济节约的原则，尽量选用价格便宜、来源方便的原料。在保证微生物生长与积累代谢产物需要的前提下，经济节约原则大致有：“以粗代精”
8、、“以野代家”、“以废代好”、“以简代繁”、“以烃代粮”、“以纤代糖”、“以氮代朊”、“以国（产）代进（口）”等方面。几种微生物培养基配方1、细菌培养基配方一 牛肉膏琼脂培养基牛肉膏 0.3 克 ，蛋白胨 1.0 克，氯化钠 0.5 克，琼脂 1.5 克，水 1000 毫升在烧杯内加水 100 毫升，放入牛肉膏、蛋白胨和氯化钠，用蜡笔在烧杯外作上记号后，放在火上加热。待烧杯内各组分溶解后，加入琼脂，不断搅拌以免粘底。等琼脂完全溶解后补足失水，用 10%盐酸或 10%的氢氧化钠调整 pH 值到 7.27.6,分装在各个试管里，加棉花塞，用高压蒸汽灭菌 30 分钟。配方二 马铃薯培养基- 3 -取
9、新鲜牛心（除去脂肪和血管）250 克，用刀细细剁成肉末后，加入 500 毫升蒸馏水和5 克蛋白胨。在烧杯上做好记号，煮沸，转用文火炖 2 小时。过滤，滤出的肉末干燥处理，滤液 pH 值调到 7.5 左右。每支试管内加入 10 毫升肉汤和少量碎末状的干牛心，灭菌，备用。配方三 根瘤菌培养基葡萄糖 10 克 磷酸氢二钾 0.5 克碳酸钙 3 克 硫酸镁 0.2 克酵母粉 0.4 克 琼脂 20 克水 1000 毫升 1%结晶紫溶液 1 毫升先把琼脂加水煮沸溶解，然后分别加入其他组分，搅拌使溶解后，分装，灭菌，备用。2、放线菌培养基配方一 淀粉琼脂培养基（高氏培养基）可溶性淀粉 2 克 硝酸钾 0.
10、1 克磷酸氢二钾 0.05 克 氯化钠 0.05 克硫酸镁 0.05 克 硫酸亚铁 0.001 克琼脂 2 克 水 1000 毫升先把淀粉放在烧杯里，用 5 毫升水调成糊状后，倒入 95 毫升水，搅匀后加入其他药品，使它溶解。在烧杯外做好记号，加热到煮沸时加入琼脂，不停搅拌，待琼脂完全溶解后，补足失水。调整 pH 值到 7.27.4，分装后灭菌，备用。配方二 面粉琼脂培养基面粉 60 克 琼脂 20 克水 1000 毫升把面粉用水调成糊状，加水到 500 毫升，放在文火上煮 30 分钟。另取 500 毫升水，放入琼脂，加热煮沸到溶解后，把两液调匀，补充水分，调整 pH 值到 7.4，分装，灭菌
11、，备用。3、真菌培养基配方一 萨市（Sabourauds）培养基蛋白胨 10 克 琼脂 20 克麦芽糖 40 克 水 1000 毫升先把蛋白胨、琼脂加水后，加热，不断搅拌，待琼脂溶解后，加入 40 克麦芽糖（或葡萄糖），搅拌，使它溶解，然后分装，灭菌，备用。本培养菌是培养许多种类真菌所常用的。配方二 马铃薯糖琼脂培养基把马铃薯洗净去皮，取 200 克切成小块，加水 1000 毫升，煮沸半小时后，补足水分。在滤液中加入 10 克琼脂，煮沸溶解后加糖 20 克（用于培养霉菌的加入蔗糖，用于培养酵母菌的加入葡萄糖），补足水分，分装，灭菌，备用。把这培养基的 pH 值调到 7.27.4，配方中的糖，如
12、用葡萄糖还可用来培养放线菌和芽孢杆菌。配方三 黄豆芽汁培养基- 4 -黄豆芽 100 克 琼脂 15 克葡萄糖 20 克 水 1000 毫升洗净黄豆芽，加水煮沸 30 分钟。用纱布过滤，滤液中加入琼脂，加热溶解后放入糖，搅拌使它溶解，补足水分到 1000 毫升，分装，灭菌，备用。把这培养基的 pH 值调到 7.27.4，可用来培养细菌和放线菌。配方四 豌豆琼脂培养基豌豆 80 粒 琼脂 5 克水 200 毫升取 80 粒干豌豆加水，煮沸 1 小时，用纱布过滤后，在滤液中加入琼脂，煮沸到溶解，分装，灭菌，备用。4、食用菌菌种培养基配方一 马铃薯蔗糖-琼脂培养基20%马铃薯煮汁 1000 毫升蔗糖
13、 20 克 琼脂 18 克把马铃薯洗净去皮后，切成小块。称取马铃薯小块 200 克，加水 1000 毫升，煮沸 20 分钟后，过滤。在滤汁中补足水分到 1000 毫升，即成 20%马铃薯煮汁。在马铃薯煮汁中加入琼脂和蔗糖，煮沸，使它溶解后，补足水分，分装，灭菌，备用。使用该培养基对 pH 值要求不严格，可以不测定。配方二 综合马铃薯培养基20%马铃薯煮汁 1000 毫升磷酸二氢钾 3 克 硫酸镁 1.5 克葡萄糖 20 克 维生素 10 毫克琼脂 18 克先配制 20%马铃薯煮汁，方法同上。在煮汁中加入上述各种组分，加热溶解后补足水分，调整 pH 值到 6。分装，灭菌，备用。 该培养基用于培养和保存灵芝、平菇、香菇等食用菌菌种。
