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1、,4.4 微生物次级代谢产物生物 合成的调节机制,微生物的新陈代谢错综复杂，参与代谢的物质又多种多样，即使是同一种物质也会有不同的代谢途径，而且各种物质的代谢间存在着复杂的相互联系和相互影响。微生物体内的次级代谢和初级代谢一样，都受菌体代谢的调节.,微生物的代谢调节主要依靠两个因素来实现，即调节参与代谢的有关酶的活性(激活或抑制)和酶量(诱导或阻遏)。,1 初级代谢对次级代谢的调节,微生物的初级代谢对次级代谢具有调节作用。当初级代谢和次级代谢具有共同的合成途径时，初级代谢的终产物过量，往往会抑制次级代谢的合成，这是因为这些终产物抑制了在次级代谢产物合成中重要的分叉中间体的合成。,如赖氨酸和青霉
2、素的生物合成过程中有共同中间体a氨基己二酸，当培养液中赖氨酸过量时，则抑制a氨基己二酸的合成，进而影响到青霉素的合成。,2 碳代谢物的调节,一般情况下，凡是能被微生物快速利用、促进产生菌快速生长的碳源，对次级代谢产物生物合成都表现出抑制作用(表4-2)。这种抑制作用并不是由于快速利用碳源直接作用的结果，而是由于其代谢过程中产生的中间产物引起的。,葡萄糖效应,阻遏作用是由于菌体在生长阶段，速效碳源(如葡萄糖和柠檬酸等)的分解产物阻遏了次级代谢过程中酶系的合成，只有当这类碳源耗尽时，才能解除其对参与次级代谢的酶的阻遏，菌体才能转入次级代谢产物的合成阶段。,青霉素发酵中加入葡萄糖，有利于菌体生长，却
3、抑制了青霉素的合成；而在培养基中加入乳糖，由于乳糖需要水解为葡萄糖和半乳糖，因此利用较为缓慢，对青霉素的合成没有抑制作用。,放线菌素的生物合成过程中抗生链霉菌生物合成吩恶嗪酮合成的酶(PHS)受到碳分解产物的调控，高浓度的葡萄糖强烈地阻遏其合成，但却不能阻遏经pPH24转化的变青链霉菌中PHS的合成，这个事实提示从抗生链霉菌中克隆到的DNA片段带有自己的启动子，没有产生葡萄糖效应的调节序列，或是在变青链霉菌中不存在参与调控的负调节蛋白。,常采用其他碳源,生物合成都受到葡萄糖的阻遏的许多次级代谢产物，如麦角生物碱、头孢菌素C、螺旋霉素、紫色杆菌素、嘌呤霉素、吲哚霉素.新生霉素合成，如果培养基中柠
4、檬酸和葡萄糖同时存在，菌体优先利用柠檬酸，此时不合成新生霉素，只有当柠檬酸被耗竭和出现二次生长时，菌体才开始利用葡萄糖并合成新生霉素。,对大肠杆菌的碳代谢物阻遏实质的研究表明阻遏作用是葡萄糖通过细胞膜进入细胞时被磷酸化，在脱磷酸化的过程中磷酸转移酶(PCT)系统灭活了腺苷酸环化酶，从而减少了细胞内的环腺苷酸(cAMP)的形成。外源加入cAMP可以解除阻遏作用。实验还证明这种分解代谢产物的阻遏作用是发生在转录水平上的。,3 氮代谢物的调节,蛋白质、黄豆饼粉等利用较慢的氮源，可以防止和减弱氮代谢物的阻遏作用，有利于次级代谢产物的合成；无机氮或简单的有机氮等容易利用的氮作为氮源(胺盐、硝酸盐、某些氨
5、基酸)时，能促进菌体的生长，却不利于次级代谢产物的合成 .,谷氨酸和丙氨酸能阻遏参与放线菌素合成的犬尿氨酸甲酰胺酶的形成，抑制放线菌素的合成； 半胱氨酸和甲硫氨酸能阻遏参与链霉素生物合成的甘露糖苷链霉素合成酶的形成，影响链霉素的合成； 铵能阻遏参与B-内酰胺抗生素生物合成的三肽合成酶(ACV)和脱乙酰氧头孢菌素C合成酶的形成，导致它们的合成受到抑制。,高浓度的NH4+和一些氨基酸阻遏利福霉素、放线菌素、氯霉素、白霉素和黄曲霉素等抗生素，这主要是因为NH4+与谷氨酰胺合成酶(GS)有关，浓度越高，GS活力越低，抗生素的合成能力也越低。,利福霉素的合成中，发现硝酸盐能促进其生物合成，原因：硝酸盐的
6、存在可以促进糖代谢和三羧酸循环酶系的活力以及琥珀酰CoA转化为甲基丙二酰CoA的酶活力，从而为利福霉素的合成提供更多的前体；硝酸盐可以抑制脂肪酸合成，使部分合成脂肪酸的前体乙酰CoA转为合成利福霉素脂肪环的前体；硝酸盐还能促进菌体GS的活力， 使GS浓度降低,同样增加利福霉素前体的浓度。,4 磷酸盐的调节,过量磷酸盐对四环类、氨基糖苷类和多烯类、大环内酯类等32种抗生素的生物合成产生阻抑作用。这些次级代谢产物的生物合成只有在适当的磷酸盐浓度下才能进行。磷酸盐浓度的高低还能调节次级代谢产物合成期出现的早晚，当磷酸盐接近耗尽时，才开始进入次级代谢产物的合成期。磷酸盐起始浓度高，耗尽时间长，合成期就
7、向后拖延。,磷酸盐还能使处于非生长状态的、产抗生素的菌体逆转成生长状态的、不产抗生素的菌体。,4.1 促进初级代谢、抑制次级代谢,磷酸盐对初级代谢途径中的许多酶(如磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)有刺激作用，因而促进初级代谢，并提供大量的初级代谢中间产物以满足微生物快速生长对大分子生物合成的需要。初级代谢的加速，竞争了合成初级代谢产物和次级代谢产物共用的分叉中间体，从而抑制了次级代谢产物的合成。,4.2 抑制次级代谢产物前体的形成,磷酸盐抑制参与次级代谢产物前体合成酶的活性，从而抑制次级代谢产物前体的形成，影响次级代谢产物的生物合成。如合成聚酮体的前体丙二酰CoA，是由磷酸烯醇式丙酮酸经
8、羧化和脱羧而来的，磷酸盐对磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶有抑制作用，从而减少前体丙二酰CoA的浓度，进而影响次级代谢产物的合成。,肌醇是链霉素合成的一个前体，它由6-磷酸-葡萄糖环化酶催化形成，而磷酸盐能增加对环化酶有竞争性抑制作用的焦磷酸的合成，使得肌醇的合成受到抑制，抑制了链霉素的生物合成。另外，过量的磷酸盐抑制单磷酸己糖途径，使碳代谢有利于糖酵解途径。,许多抗生素的生物合成与单磷酸己糖途径有关，如参与核苷类抗生素生物合成的核糖、芳香体结构抗生素的重要中间体莽草酸等，糖代谢途径的改变，减少了这些前体物质的供应，从而抑制次级代谢产物的合成。,4.3 阻遏次级代谢产物合成中某些关键酶的合成,次级代谢产
9、物的生物合成是由一系列酶促反应完成的，磷酸盐阻遏次级代谢产物合成过程中一些关键酶的合成，从而抑制次级代谢产物的形成。在链霉素合成中，转脒基酶和催化N脒基链霉胺磷酸化的链霉胺激酶都是链霉素生物合成的关键酶，这两种酶的合成均受到磷酸盐阻遏。,泰乐菌素结构中氨基糖合成中的一些关键酶，如脱水酶、氧化还原酶和转甲基酶也都受到磷酸盐阻遏。合成杀念菌素的前体，即对氨基苯甲酸(PABA)是次级代谢所特有的酶(对氨基苯甲酸合成酶)以分枝酸为底物合成的，对氨基苯甲酸合成酶的形成受到磷酸盐的强烈阻遏，它是在转录水平进行调控的，当磷酸盐的浓度达到75 mmol/L时，对氨基苯甲酸合成酶的mRNA的合成将下降95，10
10、mmol/L的磷酸盐就能完全抑制其合成。,4.4 抑制次级代谢产物合成中某些关键酶的活性,碱性磷酸酯酶是链霉素、紫霉素及万古霉素等抗生素生物合成中的一个关键酶，它催化一些中间体的脱磷酸反应，过量的磷酸盐抑制磷酸酯酶的活性。磷酸酯酶的活性与链霉素的合成具有正相关性，如果培养基中磷酸盐的浓度合适，菌体在生长期磷酸盐将被利用，开始进入链霉素合成阶段时，可以立刻观察到碱性磷酸酯酶活力的增加。,在链霉素的生物合成中有几步磷酸酯酶所催化的去磷酸化反应，过量的磷酸盐能抑制这几步的一个或多个磷酸酯酶的活性，因而抑制链霉素的合成。特别值得一提的是链霉素合成的最后一个中间体是链霉素磷酸酯，必须经碱性磷酸酯酶的作用
11、脱去磷酸根才能生成链霉素，过量的磷酸盐抑制了该酶的活性，使该反应不能顺利进行，导致无活性的链霉素磷酸酯的积累，抑制了具有抗菌活性的链霉素的合成。,4.5增加菌体能荷状态，促进初级代谢,能荷可按下式计算： EC()=(ATP+12ADP) (ATP+ADP+AMP)X100,通常情况下，高产的次级代谢产物产生菌株体内的ATP浓度比低产菌株低，细胞内ATP水平可以通过培养基中磷酸盐的浓度来调节。如果在培养基中加入过量的磷酸盐，可以大大提高菌体内ATP浓度，降低次级代谢产物的合成。,例如，在合成杀假丝菌素的灰色链霉菌培养液中添加5 mmol/L的磷酸盐，产生菌对氧的需要量显著增加，细胞内ATP浓度增
12、大，抗生素的合成立即停止，同时还伴有RNA、DNA和蛋白质的合成速率恢复到菌体生长期的速率水平，促进了初级代谢；当磷酸盐被耗尽时，菌体的生长速率开始下降，抗生素的合成又重新开始。,在菌体迅速生长期，过量磷酸盐存在，可以使次级代谢产物合成酶类不能形成，也可以抑制次级代谢产物合成酶的活性，说明磷酸盐的调节是在转录水平上进行的。,5 ATP调节,ATP直接影响次级代谢产物合成和糖代谢中某些酶的活性。 四环素的生物合成,磷酸烯醇式丙酮酸,乙酰CoA,乙酰CoA羧化酶,丙二酰CoA,菌体生长期占主导地位,磷酸烯醇式丙酮酸,羧化酶,草酰乙酸,羧基转移酶,四环素合成期起决定作用,两条途径,因此，强化第二条途
13、径有利于四环素的合成。而第二条途径中的草酰乙酸是TCA循环中的重要中间产物，催化其形成的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的合成受ATP和过量磷酸盐的强烈抑制，从而降低了草酰乙酸的生成，最终降低了四环素生物合成前体丙二酰CoA的浓度，影响四环素的生物合成。,4.6 酶的诱导调节,诱导酶需要有诱导物存在才能形成。在次级代谢过程中，有些参与次级代谢产物合成的酶为诱导酶，如链霉素生物合成中的转脒基酶、甘露糖链霉素酶等。甘露糖链霉素酶的形成需要a甲基甘露糖、甘露聚糖等诱导物的存在，其中以酵母的甘露聚糖的诱导效果为最好。,目前，底物的诱导机理虽然并不完全清楚，但这些诱导物确实起诱导作用，能提高次级代谢产物的产量。,
14、例如，蛋氨酸能提高头孢菌素C的产量，其原因是蛋氨酸的诱导作用，而不是作为硫源的供给物；又如，6-氨基葡萄糖-2-去氧链霉胺诱导卡那霉素生物合成中卡那霉素乙酰基转移酶的合成，它的加入可以提高卡那霉素的产量。,诱导酶合成的诱导剂有些需外源加入，称外源诱导剂，有些是菌体代谢过程中自身产生的，则称内源诱导剂。在抗生素的发酵过程中，有的初级代谢产物似乎对次级代谢产物的合成酶也起诱导作用。,47 反馈调节,在次级代谢产物合成中，反馈调节起着重要作用。一方面是次级代谢产物本身的过量积累，存在着与初级代谢相似的反馈调节现象。例如，氯霉素作为次级代谢产物阻遏该代谢途径中的第一个酶芳基胺合成酶，培养液中氯霉素的积
15、累，降低氯霉素的产量；卡那霉素阻遏卡那霉素乙酰基转移酶，影响卡那霉素的合成。此外，泰乐菌素、制霉菌素、瑞斯托霉素等抗生素都对本身的合成有抑制作用。,另一方面，初级代谢和次级代谢途径是紧密相连的，初级代谢受到的反馈调节，也必然影响次级代谢产物的合成。例如，缬氨酸自身反馈抑制乙酰羟酸合成酶的活性，从而影响了青霉素的合成。分叉中间体对初级代谢终产物的反馈调节可能影响次级代谢产物的合成。如赖氨酸反馈抑制同型柠檬酸合成酶的活性，抑制了青霉素合成的起始单位a-氨基己二酸的合成，必然影响青霉素的生物合成。,4.8 酶活力调节,酶活力调节是指一定数量的酶通过其分子构象或分子结构的改变来调节其催化反应的速率，一
16、般是通过激活或抑制已有酶的活力来实现，其特点是反应快速。,(1)酶激活作用,酶的激活剂主要是金属离子，但由于激活只能通过外源提供，不属于代谢激活。代谢激活作用是指代谢物对酶的激活，包括前体激活和代谢中间产物的反反馈激活两种情况。前体激活是指代谢途径中后面的酶促反应可被此途径前面的一个中间产物所促进，例如粪链球菌。乳酸脱氢酶的活力，可以被前体物质1，6-二磷酸果糖促进。代谢中间产物激活是指代谢中间产物对该代谢途径的前面酶起激活作用，激活的方式并不多见，较著名的例子是l，6-二磷酸果糖是果糖激酶的激活剂。,(2)酶抑制作用,抑制和激活相反，可降低酶的活力。在代谢调节过程中所发生的抑制现象主要是可逆的，而且大多数属于反馈抑制。反馈抑制是指代谢的末端产物对酶活力的抑制,无分支代谢途径的调节：通常是在线形的代谢途径中末端产物对催化第一步反应的酶活力有抑制作用。 有分支代谢途径的调节：即有两种或两种以上的末端产物，调节方式较复杂，其共同特点是每个分支途径的末端产物控制分支点后的第一个酶，同时每个末端产物又对整个途径的第一个酶有部分的抑制作用,
