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1、重组人工胰岛素姓名：胡霞学号：201014010140班级：10 级生科 1 班重组人工胰岛素胡霞一、 概念1、概念： 重组 DNA技术生产的由 51个氨基酸残基组成的蛋白质，宿主细胞为大肠杆菌。按干燥品计算，每 1mg含重组人胰岛素不得少于 27.5单位。重组人胰岛素中残余宿主 DNA和宿主细胞蛋白质为与生产过程相关的、潜在的特异性杂质，必须在生产过程中严格控制，其限度应符合有关规定。2、形状该品为白色或类白色的结晶性粉末。该品在水、乙醇和乙醚中几乎不溶，在稀盐酸和稀氢氧化钠溶液中易溶。3、物化性分子量：5807.57022分子式：C 257H383N65O77S6水溶性：2.0: 2 mg
2、/mL储存条件：2-8C二、工艺流程1重组人工胰岛素的生产原理 通过基因工程酵母菌发酵生产hPI，经后加工形成hI。酵母系统下游后加工比细菌表达系统简单，但缺点是生产慢，生产周期长，且重组蛋白分泌量少(150 mgL)，产量低。因此，虽然rhI投放市场已久，但人们一直在努力寻求和探索更加有效的表达系统和高效的表达策略I2 J，尤其是对ECO一尻表达系统的研究更是越来越深入，用Ecoli系统表达hPI的策略也越来越多。另一方面，在胰岛素的基因工程生产中，下游处理非常复杂，复杂的下游处理极大地降低了胰岛素的最终收率。本研究围绕着提高重组目的蛋白表达量，简化下游处理过程等方面进行探索，建立了一套经过
3、优化的高效完整的基因工程Ecoli发酵表达(His)6一ArgArg一人胰岛素原(His)6一ArgArghuman proinsulin，PPhPI，后加工成hI的制备工艺。2重组人工胰岛素的生产工艺流程2.1菌种的制备2.1.1目的基因的提取既从人的 DNA中提取胰岛素基因，可使用限制性内切酶将目的基因从原DNA中分离。主要有如下 4种方法：（1）鸟枪法：用一大堆限制性核酸内切酶对附近基因进行剪切，再提取所需要的。至于如何筛选，用 DNA分子杂交，即 DNA探针（2）人工合成法：根据转录蛋白或者 mRNA推导出基因序列，然后人工合成，没有内含子。（3）从基因文库中提取：也就是事先已经提取完
4、毕的拿来用（4）PCR 扩增技术：用于大量生产该段基因片段，用于商业化运作。2.1.2提取质粒使用细胞工程,培养大肠杆菌，从大肠杆菌的细胞质中提取质粒质粒为环状。碱裂解法：此方法适用于小量质粒 DNA的提取，提取的质粒 DNA可直接用于酶切、PCR 扩增、银染序列分析。2.1.3基因重组将取出目的基因与质粒，先利用同种限制性内切酶将质粒切开，再使用 DNA连接酶将目的基因与质粒“缝合”，形成一个能表达出胰岛素的 DNA质粒。2.1.4将质粒送回大肠杆菌再大肠杆菌的培养液中加入含有 Ca+的物质，如 CaCl2,这使细胞会吸收外源基因，此时将重组的质粒也放入培养液中，大肠杆菌便会将重组质粒吸收。
5、将大肠杆菌用氯化钙处理，以增大大肠杆菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒能够进入受体细胞，此时的细胞处于感受态（理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来 DNA的生理状态）。2.2胰岛素的产生和精制（即菌种的发酵培养）重组人工胰岛素的工业生产制备和深加工技术在如今已经是炉火纯青。有近百年的发酵工程为基础，结合现在的基因工程技术的产物，在菌种制备后的发酵培养过程更是可靠和安全的。发酵培养流程见下图表：对 从 菌 种 库 中 取 出 的 菌 种 进 行 活 化 及 初 步 扩 大 培 养菌种扩培 在 种 子 罐 中 对 菌 种 进 行 进 一 步 的 扩 大 培 养 ， 至 菌 种 到
6、对 数 生 长 期时 转 入 发 酵 罐 培 养分 两 阶 段 进 行 控 制 ， 第 一 阶 段 主 要 通 过 控 制 溶 氧 和 补 加 甘 油 使菌体 达 到 富 集 的 目 的 ， 第 二 阶 段 通 过 补 加 甲 醇 使 菌 体 进 行 高 密 度表达 目 的 产 物 ， HPLC检 测 目 的 产 物 含 量目 的 产 物 存 在 于 发 酵 液 上 清 中 ， 此 步 骤 主 要 控 制 目 的 产 物 收 率通 过 两 步 柱 层 析 ， 分 别 去 除 发 酵 上 清 液 中 的 色 素 和 杂 蛋 白利 用 紫 外 检 测 仪 控 制 目 的 产 物 收 率 ， 主 要
7、 试 剂 为 乙 醇 与 异 丙 醇调 节 PH值 ， 使 P1沉 淀 ， 再 经 离 心 干 燥 ， 得 中 间 体 I固 体控 温 进 行 转 肽 反 应 ， 主 要 试 剂 为 DMSO与 1,4-丁 二 醇再 通 过 柱 层 析 进 行 提 纯 ， 主 要 试 剂 为 异 丙 醇调 节 PH值 ， 使 P2沉 淀 ， 再 经 离 心 干 燥 ， 得 中 间 体 II固 体通 过 控 制 湿 度 与 温 度 进 行 脱 帽 反 应 ， 得 到 终 产 物 胰 岛 素主 要 试 剂 为 丙 酮 ， 产 品 为 半 固 体经 过 两 步 柱 层 析 对 胰 岛 素 进 行 提 纯 ， 试 剂
8、 为 Tris-HCl和 异 丙 醇通 过 超 滤 对 提 纯 后 的 胰 岛 素 进 行 浓 缩 ， 通 过 管 道 传 递 到 下 工 序发酵罐培养P2纯化P2沉淀、干燥脱帽成品粗纯化P1沉淀、干燥发酵液固液分离P1纯化种子罐培养通 过 制 备 色 谱 对 胰 岛 素 粗 品 进 行 精 制 ， 主 要 试 剂 为 色 谱 乙 腈然 后 经 两 步 结 晶 后 通 过 管 道 过 滤 除 菌 到 百 级 区对 胰 岛 素 成 品 进 行 一 次 结 晶 和 水 洗对 水 洗 后 的 胰 岛 素 进 行 过 滤 除 菌 后 冻 干 ， 即 得 胰 岛 素 成 品制得的胰岛素经过深加工，可以得
9、到片剂，注射剂和肺部吸入制剂等。3药物检测这种重组人工胰岛素的检测重点应该是 测定生物活性 效价测定 控制产品中杂质潜在有害物质 保证产品安全性和有效性三、问题与展望胰岛素在糖尿病治疗中具有无可替代的作用和地位，但因注射给药让许多患者产生畏惧心理，使其作用发挥受到限制。为了减少不便和疼痛，医药界正在全力以赴投入研究，开发更新的胰岛素剂型及给药方式。目前有关新式胰岛素产品的研究方向，可归纳为 3类:1.新的给药方式，例如:口服、吸入;2.改变药物代谢机制;3.改进注射手段，让使用者无痛;这是国际国内胰岛素类药物研究发展的前沿和趋势。3.1非注射型胰岛素让胰岛素和其他药物一样成为非注射型药品，通过
10、口服、鼻吸等途径进入人体而免除注射，需要研究解决制剂吸收的问题。由于胰岛素本身的疗效和安全性已经非常确定，而改变的是给药途径，因此吸收程度和速度是需要解决的首要问题。3.2口服胰岛素胰岛素本身为蛋白质，口服后会被胃肠道降解破坏，所以常规胰岛素不能口服。口服给药受到胃酸、蛋白分解酶、大分子吸收、肝脏首过效应等影响，因此，口服胰岛素的研究方向主要在以下几方面:过滤冻干成品精纯化1.选用惰性材料如高分子纤维素，制成了微小包裹球。这种小球在胃中不溶，保护胰岛素不被破坏。现阶段的研究成果可保持其生物有效性达到皮下注射给药的一半。2.加入酶抑制剂，将蛋白酶抑制剂与胰岛素一起包裹在小球中，可有助于提高胰岛素
11、的吸收。3.加入吸收促进剂，将胰岛素与吸收促进剂同时给药，能进一步促进口服胰岛素吸收，其中的螯合剂能与肠粘膜上活性离子结合，造成膜通道通透性增加而促进药物在肠道吸收。国内外有关口服胰岛素研究报道虽然很多，但至今未见到实际应用于临床。其主要原因是口服生物利用度低、制剂的稳定性、质量标准等问题尚未解决。口服胰岛素的成功与否在于如何解决其在胃肠道的活性和稳定性，一旦成功将是胰岛素研究的重大突破。3.3经肺吸入胰岛素胰岛素经肺吸入给药，是替代注射最有希望的途径之一。肺部特殊的生理构造是具有极大的肺泡表面积。此点优势具有决定性，使胰岛素这样的大分子药物吸收成为可能;药物可迅速到达;不必经过肝脏首过效应;
12、提高了药物的生物利用度。另外重要的一点，胰岛素在肺部吸收的速度快，符合内源性胰岛素的释放特征和人体的需要，并且可以在进餐的同时应用，而使用药更加方便。最新的进展是采用干粉剂型，其优于早先的液体气雾剂。干粉的稳定性好，保质期可达两年;干粉的载药量高，仅需吸 13 次即可满足剂量要求，而如果用喷雾则需深吸几十次。胰岛素吸入制剂在国外已进入第二、三期临床试验，一些制药公司的专家相信在不久的将来就会投入使用。此项技术已经引起了广泛的关注，但其面临尚待解决的问题是:药物吸收的稳定性、成本高以及对肺功能的影响等，通过临床试验和上市的时间尚属未知。吸入胰岛素相对于传统的注射方式的优越性不言而喻，且理论上颇具
13、可行性，我们的医生和患者都在热切盼望中。3.4其他非注射给药方式正在研究中的其他非注射胰岛素给药途径包括:口腔喷雾、鼻腔给药、直肠栓剂给药、滴眼剂、透皮或口腔粘膜给药。这些非注射给药途径都有一些难以克服的问题，如吸收缓慢、药峰浓度低、生物利用度低等，均不能达到注射剂的效果，目前尚无法适合糖尿病临床治疗的需要。胰岛素非注射给药是医药界的重大和热门研究课题，其结果对糖尿病治疗产生深远影响。国内外的专家学者正致力于相关的研究开发。参考文献:1 李晓红,朱慧玲，余荣，李红霞.重组人工胰岛素制备工艺M.四川大学学报,2007,39 卷第 4期.2 王琼庆，冯佑民.胰岛素蛋白质研究进展.生物化学与生物物理进展,1996,23(5):402.3 张晓刚，李志华.发酵工程制药。北京工业出版社,20044 陈来同,孙宇.B19-Gly-B20 人胰岛素的分离纯化及性质研究J.中国生化药物杂志,2001,22(5):234 5张友尚.胰岛素生产的回顾与展望J.食品与药,2008,10 卷第 01期6 李湛君，杨昭鹏，徐康森.重组人胰岛素效价测定中生物测定与理化测定的相关性验证.药物分析杂志，1998，18(4)：241
