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1、三聚氰胺的性质及检测方法2011 级食工一班 郭佳 1701120110111 三聚氰胺的理化性质三聚氰胺（英文：Melamine）分子式为 C3H6N6,分子量为 126. 12,俗称密胺、蛋白精，IUPAC 命名为 “1,3,5-三嗪-2,4,6- 三胺 ”，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，为白色单斜晶体,无毒、无味,不可燃烧, 可溶于甲醇、甲醛、乙酸、甘油及吡啶等,微溶于水、乙醇,不溶于苯、乙醚、四氯化碳。相对密度为 1. 573g/cm3,熔点为 354高温下可分解产生含氢化氰、氮氧化物和氨等有毒和刺激性的烟雾。三聚氰胺呈弱碱性,在中性或弱碱性环境下能与甲醛缩合形成各种羟甲基三聚氰胺,
2、但在微酸性(pH 值 5. 56. 5)环境下,可以与羟甲基的衍生物进行缩聚反应而生成树脂产物。另外,三聚氰胺三种同系物:三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸二酰胺。三聚氰胺是一种用途十分广泛的有机化工原料，对身体有害，不可用于食品加工或食品添加物。三聚氰胺部分物理性质：熔点()：300 （升华）相对密度（水=1）：1.573相对蒸气密度（空气=1）：4.34饱和蒸气压(kPa)：6.66水中溶解度(20) ：0.33g2 三聚氰胺的毒性动物长期摄入三聚氰胺会造成生殖、泌尿系统的损害,膀胱、肾部出现结石,并可进一步诱发膀胱癌对于肾脏，短期高浓度接触后会引起肾结石、急性肾衰，长期接触还会造成肾脏组
3、织损伤。 。三聚氰胺同系物具有三聚氰胺一样的毒性效应,很多研究都将它们作为三聚氰胺复合物(MCs)进行总体毒理学评价。3 第一法 高效液相色谱法（HPLC）3.1 原理试样用三氯乙酸溶液-乙腈提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，用高效液相色谱测定，外标法定量。3.2 试剂与材料除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。甲醇乙腈氨水三氯乙酸柠檬酸辛烷磺酸钠甲醇水溶液三氯乙酸溶液（1）氨化甲醇溶液（5）离子对试剂缓冲液三聚氰胺标准品三聚氰胺标准储备液阳离子交换固相萃取柱定性滤纸海砂微孔滤膜氮气3.3 仪器和设备高效液相色谱（HPLC）仪分析天平离心机超声波水浴固相萃
4、取装置氮气吹干仪涡旋混合器具塞塑料离心管研钵3.4 样品处理3.4.1 提取3.4.1.1 液态奶、奶粉、酸奶、冰淇淋和奶糖等称取 2 g（精确至 0.01 g）试样于 50 mL 具塞塑料离心管中，加入 15 mL三氯乙酸溶液和 5 mL 乙腈，超声提取 10 min，再振荡提取 10 min 后，以不低于 4000 r/min 离心 10 min。上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，用三氯乙酸溶液定容至 25 mL，移取 5 mL 滤液，加入 5 mL 水混匀后做待净化液。3.4.1.2 奶酪、奶油和巧克力等 称取 2 g（精确至 0.01 g）试样于研钵中，加入适量海砂（试样质量的 4
5、倍6 倍）研磨成干粉状，转移至 50 mL 具塞塑料离心管中，用 15 mL 三氯乙酸溶液分数次清洗研钵，清洗液转入离心管中，再往离心管中加入 5 mL 乙腈，余下操作同 3.4.1.1 中“超声提取 10 min，加入 5 mL 水混匀后做待净化液” 。注：若样品中脂肪含量较高，可以用三氯乙酸溶液饱和的正己烷液-液分配除脂后再用 SPE 柱净化。3.4.2 净化将 3.4.1 中的待净化液转移至固相萃取柱中。依次用 3 mL 水和 3 mL 甲醇洗涤，抽至近干后 ，用 6 mL 氨化甲醇溶液洗脱。整个固相萃取过程流速不超过 1 mL/min。洗脱液于 50下用氮气吹干，残留物（相当于 0.4
6、 g 样品）用 1 mL 流动相定容，涡旋混合 1 min，过微孔滤膜后，供 HPLC 测定。3.5 高效液相色谱测定3.5.1 标准曲线的绘制用流动相将三聚氰胺标准储备液逐级稀释得到的浓度为 0.8、2、20、40、80 g/mL 的标准工作液，浓度由低到高进样检测，以峰面积-浓度作图，得到标准曲线回归方程。基质匹配加标三聚氰胺的样品 HPLC 色谱图参见附录 A 中的图 A1.3.5.2 定量测定待测样液中三聚氰胺的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进样分析。3.5.3 结果计算试样中三聚氰胺的含量由色谱数据处理软件或按式（1）计算获得：A c V1000 X= f （
7、1）As m1000 式中：X 试样中三聚氰胺的含量，单位为毫克每千克（mg/kg） ；A 样液中三聚氰胺的峰面积；c 标准溶液中三聚氰胺的浓度，单位为微克每毫升（g/mL） ；V 样液最终定容体积，单位为毫升（mL） ；As 标准溶液中三聚氰胺的峰面积；m 试样的质量，单位为克（g） ；f 稀释倍数。3.6 空白实验 除不称取样品外，均按上述测定条件和步骤进行。3.7 方法定量限本方法的定量限为 2 mg/kg。3.8 回收率在添加浓度 2 mg/kg10 mg/kg 浓度范围内，回收率在 80%110%之间，相对标准偏差小于 10%。3.9 允许差在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对
8、差值不得超过算术平均值的 10%。4 第二法 液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS）4.1 原理试样用三氯乙酸溶液提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，用液相色谱-质谱/质谱法测定和确证 ，外标法定量。4.2 试剂与材料除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。乙酸。乙酸铵。乙酸铵溶液（10 mmol/L）：准确称取 0.772 g 乙酸铵于 1 L 容量瓶中， 用水溶解并定容至刻度，混匀后备用。其他同 3.2。4.3 仪器和设备液相色谱-质谱/质谱（LC-MS/MS）仪：配有电喷雾离子源（ESI） 。其他同 3.3。4.4 样品处理4.4.1 提取奶粉称取
9、1 g（精确至 0.01 g）试样于 50 mL 具塞塑料离心管中，加入 8 mL 三氯乙酸溶液和 2 mL 乙腈，超声提取 10 min，再振荡提取 10 min 后，以不低于4000 r/min 离心 10 min。上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，做待净化液。4.4.2 净化将 4.4.1 中的待净化液转移至固相萃取柱中。依次用 3 mL 水和 3 mL 甲醇洗涤，抽至近干后 ，用 6 mL 氨化甲醇溶液洗脱。整个固相萃取过程流速不超过 1 mL/min。洗脱液于 50下用氮气吹干，残留物（相当于 1 g 试样）用 1 mL 流动相定容，涡旋混合 1 min，过微孔滤膜后 ，供 LC
10、-MS/MS 测定。4.5 液相色谱-质谱/质谱测定4.5.1 标准曲线的绘制取空白样品按照 4.4 处理。用所得的样品溶液将三聚氰胺标准储备液逐级稀释得到的浓度为 0.01、0.05、0.1、0.2、0.5 g/mL 的标准工作液，浓度由低到高进样检测，以定量子离子峰面积- 浓度作图，得到标准曲线回归方程。基质匹配加标三聚氰胺的样品 LC-MS/MS 多反应监测质量色谱图参见附录 A 中的图 A.2。4.5.2 定量测定待测样液中三聚氰胺的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进样分析。4.5.3 定性判定按照上述条件测定试样和标准工作溶液，如果试样中的质量色谱峰保留时间与标
11、准工作溶液一致（变化范围在2.5%之内） ；样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表1 的规定，则可判断样品中存在三聚氰胺。表 1 定性离子相对丰度的最大允许偏差相对离子丰度 50% 20%至 50% 10%至 20% 10%允许的相对偏差 20% 25% 30% 50%4.5.4 结果计算同 3.5.4。4.6 空白实验除不称取样品外，均按上述测定条件和步骤进行。4.7 方法定量限本方法的定量限为 0.01 mg/kg。4.8 回收率在添加浓度 0.01 mg/kg0.5 mg/kg 浓度范围内，回收率在 80%110%之间，相对标准偏差小
12、于 10%。4.9 允许差在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 15%。5 第三法 气相色谱-质谱联用法（GC-MS 和 GC-MS/MS）5.1 原理试样经超声提取、固相萃取净化后，进行硅烷化衍生，衍生产物采用选择离子监测质谱扫描模式（SIM）或多反应监测质谱扫描模式（MRM） ，用化合物的保留时间和质谱碎片的丰度比定性，外标法定量。5.2 试剂与材料除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。吡啶乙酸铅衍生化试剂：N,O-双三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）三甲基氯硅烷（TMCS） （9910)。乙酸铅溶液（22 g/L）三聚氰胺
13、标准溶液氩气氦气其他同 3.2。5.3 仪器和设备气相色谱-质谱（GC-MS）仪气相色谱-质谱/质谱（GC-MS/MS）仪：配有电子轰击电离离子源（EI） 。电子恒温箱。其他同 3.3。5.4 样品处理5.4.1 GC-MS 法5.4.1.1 提取奶粉称取 5 g（精确至 0.01 g）样品于 50 mL 具塞比色管，加入 25 mL 三氯乙酸溶液，涡漩振荡 30 s，再加入 15 mL 三氯乙酸溶液，超声提取 15 min，加入2 mL 乙酸铅溶液，用三氯乙酸溶液定容至刻度。充分混匀后，转移上层提取液约 30 mL 至 50 mL 离心试管，以不低于 4000 r/min 离心 10 min
14、。上清液待净化。5.4.1.2 净化准确移取 5 mL 的待净化滤液至固相萃取柱中。再用 3 mL 水、3 mL 甲醇淋洗，弃淋洗液，抽近干后用 3 mL 氨化甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，50下氮气吹干。5.4.2 GC-MS/MS 法奶粉称取 0.5 g（精确至 0.01 g）试样，加入 5 mL 甲醇水溶液，涡 旋 混 匀2 min 后，超声提取 15 min 20 min，以不低于 4000 r/min 离心 10 min，取上清液 200 L 用微孔滤膜过滤，50下氮气吹干。5.4.3 衍生化取上述氮气吹干残留物，加入 600 L 的吡啶和 200 L 衍生化试剂，混匀，70反应 30
15、min 后，供 GC-MS 或 GC-MS/MS 法定量检测或确证。5.5 气相色谱-质谱测定5.5.1 标准曲线的绘制5.5.1.1 GC-MS 法准确吸取三聚氰胺标准溶液 0、0.4、0.8、1.6、4、8、16 mL 于 7 个 100 mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。各取 1 mL 用氮气吹干，按照 5.4.3 步骤衍生化。配制成衍生产物浓度分别为 0、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2 g/mL 的标准溶液。反应液供 GC-MS 测定。以标准工作溶液浓度为横坐标，定量离子质量色谱峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。标准溶液的 GC-MS 选择离子质量色谱图参见附录 A 中的图
16、A.3，三聚氰胺衍生物选择离子质谱图参见附录 A 中的图 A.4。5.5.1.2 GC-MS/MS 法准确吸取三聚氰胺标准溶液 0、0.04、0.08、0.4、0.8、4、8 mL 分别于 7个 100 mL 容量瓶中 ，用甲醇稀释至刻度。各取 1 mL 用氮气吹干，按照 5.4.3步骤衍生化。配制成衍生化产物浓度分别为0、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1 g/mL 的标准溶液。反应液供 GC-MS/MS测定。以标准工作溶液浓度为横坐标，定量离子质量色谱峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。标准溶液的 GC-MS/MS 多反应监测质量色谱图参见附录 A 中的图 A.5。5.5.2 定量测定待测样液中三聚氰胺的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应对净化液稀释，重新衍生化后再进样分析。5.5.3 定性判定5.5.3.1 GC-M
