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1、本科学生实验报告学号 104120434 姓名 穆志国 学院 生命科学学院 专业、班级 10 生物技术 实验课程名称 纤维素酶最适反应温度的测定 指导教师及职称 李俊俊 开课时间 2012 至 2013 学年 下 学期填报时间 2013 年 4 月 17 日一、实验目的1、了解不同温度条件对酶活性的影响2、掌握酶最适反应温度的测定方法二、实验原理温度对酶促反应速率的影响有两方面：一方面，温度升高可加快分子运动速率，提高分子碰撞概率，从而使反应速率加快；另一方面，温度升高可能使酶蛋白逐步变性而失活，从而降低酶促反应速率。温度对酶促反应速率的影响是这两方面作用的综合结果。所以只有在某一温度范围内时
2、，酶促反应速率才会随着温度的升高而升高，达到最大反应速率时的温度称为酶作用的最适温度（Optimum Temperature） 。将其它条件（如酶浓度、底物浓度、pH 、反应时间等）固定在最适状态，然后在一系列不同温度条件下进行酶活力测定。绘制得到温度酶活力曲线。酶的最适温度并不是酶的特征常数，受其它因素的影响。3、实验试剂1、柠檬酸钠缓冲液，0.05mol/L pH4.（适用于酸性纤维素酶）2、磷酸缓冲液， 0.1mol/L pH6.0（适用于中性纤维素酶）3、CMC-Na 溶液（底物溶液， pH4.8 和 pH6.0 ）4、DNS 试剂（ CMCA-DNS）5、纤维素酶液（ pH4.8 和
3、 pH6.0）4、实验仪器1、分光光度计 2、沸水浴 3、恒温水浴（1000.1）4、分析天平（感量 0.1mg） 5、移液器 6、计时器7、磁力搅拌器5、实验方法1、本实验在室温至 90之间选择不同温度测定酶活力，以找出纤维素酶在此条件下的最适温度。2、 待测酶液制备称取固体纤维素酶 1g，精确至 0.1mg，用蒸馏水溶解，准确稀释定容（使试样液与空白液的吸光度之差落在 0.20.5 范围内，不在此范围内，酶液要进行重新稀释） ，待测。3、测定步骤（1）取 3 支 25mL 刻度具塞试管（1 支做空白管，2 支做样品管） 。（2）分别向 3 支管中准确加入用相应 pH 缓冲液配制的 CMC-
4、Na 溶液 2.00mL注意：加入 CMC-Na 溶液时应缓慢，不可粘在试管壁上。（3）分别准确加入稀释好的待测酶液 0.5mL 于 2 支样品管中（空白管不加） 用涡旋混合器混匀。 （ 注意：酶液一定要垂直加在底物上面，不可顺着试管壁加入）（4）将 3 支试管同时置于不同温度水浴中，准确计时，反应 30min，取出。（5）迅速准确地向 3 支管中加入 3mLDNA 试剂（加液顺序和加酶液顺序相同以保证反应时间相同） ，振荡摇匀，于空白管中准确加入稀释好的待测酶液 0.5mL，摇匀。将 3 支管同时放入沸水浴中，准确计时，煮沸 10min 取出，迅速冷却至室温，用水定容至 25mL。（6）以空
5、白管调零，在分光光度计 540nm 波长下，用 1cm 比色皿，分别测量 2 支样品管中样液的吸光度 OD 值，分别记为 ODE1、ODE2 ，取二者平均值。带入标准曲线方程计算酶活力。注意：不同温度指室温、30 、 40 、 50 、 60 、 70 、 80 、 90 4、纤维素酶酶活力计算纤维素酶酶活力（U/g）=(K平均 OD+b) N / 0.50.5式中： K标准曲线的斜率b标准曲线的截距N试样的总稀释倍数0.5反应酶液的体积，mL0.5反应时间，h酶活力的计算值保留 3 位有效数字注意：同一试样两个平行测定值的相对偏差在8%以内，二 者的平均值为最终的酶活力测定值。5、葡萄糖标准
6、曲线图一:葡萄糖标准曲线（注：在前面的实验中已经测得，可以沿用前面中实验所得的结果）6、实验结果（1） 、实验所测得的数据温度（）平均 OD 值平均 OD 值（PH=4.8）平均 OD 值（PH=6.0 ）室温（约为 26） 0.2205 0.068530 0.2845 0.247540 0.2830 0.34050 0.3830 0.220560 0.3955 0.18970 0.5025 0.14580 0.439 0.08990 0.082 0.049表一：在不同温度条件下，当 PH 值分别为 4.8 和 6.0 是测得的吸光度注：当温度为 50和 60时，使用的酶液稀释倍数为 1000
7、0 倍，而其它的温度时刻，稀释的倍数都是为 5000 倍（2） 、应用公式进行计算酶活，可以得到下表当 Ph=4.8 时 温度（） 酶活（u/ml)室温（约为 26） 2025.1230 2834.0840 2815.1250 8158.2460 8474.2470 5589.680 4786.9690 274.48表二：PH=4.8 时，不同温度下的酶活当 PH=6.0 时温度（） 酶活（u/ml)室温（约为 26） 103.8430 2366.440 3535.650 4050.2460 3253.9270 1070.880 362.9690 -142.64表二：PH=6.0 时，不同温度
8、下的酶活为更直观的表示，纤维素酶在不同温度下的变化，做出如下散点图图二：不同温度下的酶活力的变化（3） 、实验结果分析、由图二可以看出，当 PH 为 4.8 时比 PH=6.0 时酶的活力更高，说明在偏酸性的时候，纤维素酶的活力更强；、由图二可以看出，随温度的变化，酶的活力呈正态分布，温度过低时酶的活力较低，而温度过高时酶的活力也会变低，甚至失活；、由图二可以看出，当 PH=4.8 时，温度为 60时，为纤维素酶的最适酶活力温度；、由图二可以看出，当 PH=6.0 时，温度为 50时，为纤维素酶的最适酶活力温度；（4） 、实验总结通过本实验，在不同的温度条件下纤维素的酶活，让我们掌握了变温对酶活力的影响，同时也对温度对酶活力的影响有一个直观的了解。同时在实验中需要同学们的相互合作，共同配合，很能考核大家的团结能力。最后，在整一个的关于纤维素酶的实验中，前后的实验是有相互关联的，因此做每一个实验都需要认真对待，做好每一个单一的实验。7、参考文献1、谭占仙，研究 PH 值、温度对纤维素酶活力的影响，科技论坛
