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1、基因工程：通过基因操作来定向改变或修饰生物体或人类自身，并具有明确应用目的的活动称为基因工程。广义基因工程：DNA 重组技术的产业化开发与应用。上游技术：外源基因重组、克隆和表达方式的设计与构建。基因操作：对基因进行分离、分析、改造、转移、重组、表达和检测等操作总称。内含子：存在于真核生物基因中无编码意义而被切除的序列。外显子：能够翻译成蛋白质的任一间断的基因片段。粘性末端：识别位点为回文对称结构的序列劲限制酶切割后产生的互补末端。平末端：在回文对称轴上同时切割 DNA 的两条链所得平整的切口。Taq DNA 聚合酶：一种耐热的 DNA 聚合酶，发现于水生栖热菌内，顾称之 Taq DNA 聚合
2、酶。质粒：独立于染色体之外的、能自主复制的双链环状脱氧核糖核酸物质。质粒的不相容性：两个质粒在同一宿主中不能工程的现象。转化：借助于人工方法有目的的将异源 DNA 分子引入另一细胞品系使受体细胞获得新遗传性状的一种手段。克隆载体：用于扩增或保存 DNA 片段的载体。细菌的溶源化：柯斯质粒载体：人工构建的含有 噬菌体 DNA 的 cos 序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。插入型载体：通过特定的酶切位点允许外源 DNA 片段插入的载体。置换型载体：允许外源 DNA 片段替换非必须 DNA 片段的载体。人工染色体载体：基于 ARS、CEN、TEL 是线性染色体保持稳定的功能序列，人们利用这些序列
3、构建载体，重组后的 DNA 可以线性状态存在，既稳定又提高了插入外源基因的能力且可像天然染色体一样在寄主细胞中稳定复制和遗传。包涵体：外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密地集中在一起形成无膜的裸露结构。穿梭载体：能够在两种或多种宿主之间进行复制或表达的载体。整合载体：承担着将某个基因或某些基因插入到染色体中的工作的载体。分子杂交：具有互补序列的两条核酸单链按碱基配对原则形成双链的过程。DNA 复性 ：指变性 DNA 两条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象。Northern 印迹杂交：通过 RNA/DNA 杂交检测 RNA 的方法。Western 杂交印迹法：将电泳分离的非标记蛋白质
4、转移到固相载体上，用特异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量的方法。Ct 值： PCR 扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。基因组文库：是指将某生物的全部基因组 DNA 切割成一定长度的 DNA 片段克隆到某种载体上而形成的集合。cDNA：指某生物某一发育时期所转录的 mRNA 全部经反转录形成的 cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。基因组学：对物种的所有基因进行定位、作图、测序和功能分析以获得生物体全部的基因组序列。序列标签位点 STS：STS 是一段已知核苷酸序列的 DNA 片段，是基因组中任何单拷贝的短 DNA 序列，长度在100500bp 之间，易于
5、识别，仅存在于待研究的染色体或基因组中。表达序列标签(EST)：EST是一个cDNA克隆快速大规模测序后所获得的端和 端部分cDNA随机片段，每个EST长度约200600bp,代表了一个单拷贝基因的部分cDNA表达序列。基因组工程：以基因组为基础对物种进行大范围修饰和改造，用以产生新的生命力、改造物种和实现人类其他目的的工程。脂质体：一种人造的脂质小泡，外部是脂双层，内部是水腔。诱导型启动子P lac：在某些特定的物理或化学信号刺激下，可大幅度提高基因的转录水平的启动子。藻类基因工程：以海藻为研究对象将某种生物基因通过基因载体或其他手段运送到海藻活细胞中，并使之增殖(克隆)和行使正常功能(表达
6、)，从而创造出藻类新品种的遗传学技术。宏基因组：泛指某一自然环境中全部微生物的基因组群。基因漂流：转基因作物中含有从不相关的物种转入的外源基因，这些外源基因有可能通过花粉风扬或虫媒传授等途径扩散到其他物种。基因操作的主要内容有哪些？基因操作是对基因进行分离、分析、改造、转移、重组、表达和检测等操作的总称。基因操作是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体内,使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。因此，供体、受体、载体是基因操作的三大基本元件。基因操作的目的是力争外源基因的高效表达，可从哪几方面实现该目的？1、
7、利用载体DNA在受体细胞中独立于染色体DNA而自主复制的特性与载体分子重组，通过载体分子的扩增提高外源基因在受体细胞中的含量，借此提高宏观表达水平。2、筛选、修饰重组基因表达的转录调控元件：启动子、增强子、转录调控序列、操作子、终止子。3、修饰和构建蛋白质生物合成的翻译调控元件：翻译调控序列、密码子。4、外源基因在工程菌中的稳定生产及增殖。限制酶识别的序列特征是什么？1.限制酶识别序列的长度限制酶识别序列的长度一般为4-8 bp，最常见的为6个bp。当识别序列为4个和6个碱基时，它们可识别的序列在完全随机的情况下，平均每256个和4096个碱基中会出现一个识别位点。2.限制酶识别序列的结构：限
8、制酶识别的序列大多数为回文对称结构，切割位点在DNA 两条链相对称的位置。原核细胞DNA聚合酶的种类及主要功能。原核细胞有3种DNA聚合酶，都与DNA链的延长有关。聚合酶是单链多肽，可催化单链或双链DNA的延长；聚合酶则与低分子DNA链的延长有关；聚合酶在细胞中存在的数目不多，是促进DNA 链延长的主要酶。一个理想的载体应具备哪些条件？具备：1.能在宿主细胞中存在并繁殖，有功能良好的复制子和启动子，使插入基因复制和表达；2.具有多个限制性内切酶的切点，且切点是单一的；3.具有容易检测的筛选标记用于后期筛选；4.载体DNA的分子量适当，可容纳较大的外源DNA片段，又可在受体细胞内扩增较多的拷贝；
9、5.胞内稳定性高，使重组体可以稳定传代而不易丢失。选择标记与筛选标记各指什么？选择标记用于鉴别载体的存在，将成功转化了载体的细菌菌落挑选出来。筛选标记用于从含有载体的细菌菌落中进一步挑选携带外源DNA的重组载体。筛选标记主要用来区别重组质粒与非重组质粒，当一个外源DNA 片段插入到一个质粒载体上时，可通过该标记来筛选插入了外源片段的质粒，即重组质粒。-互补（ -complementation）原理以及在载体构建中的应用。大肠杆菌的 lac乳糖操纵子中的 lacZ 基因编码-半乳糖苷酶，如果 lacZ 基因发生突变，则不能合成有活性的-半乳糖苷酶。缺失了编码-半乳糖苷酶的 lacZ 基因，无酶学
10、活性；对于只编码N-端氨基酸的 lacZ 基因（称为lacZ），其产物也没有酶学活性。但这两个无酶学活性的产物混合在一起时，可恢复-半乳糖苷酶的活性，实现基因内-互补。-互补是基于在两个不同的缺陷-半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。X-gal也是-半乳糖苷酶的一种底物，经降解后可生成溴氯吲哚，使大肠杆菌菌落呈蓝色。当无-半乳糖苷酶时，X-gal不被分解，菌落呈白色。当外源基因插入到LacZ基因内部，则LacZ基因受到破坏，便不能再和缺陷型受体菌中生成有活性的-半乳糖苷酶，因此，菌落呈白色。反之，非重组体为蓝色菌落。这种颜色标志的变化就很容易区分和挑选含有和不含有插入序列或基因的转化菌落，称
11、为“蓝白斑筛选法” 。大肠杆菌表达载体的基本表达元件有哪些？1.启动子：是一段能被宿主RNA聚合酶特异性识别和结合并指导目的基因转录的DNA序列，是基因表达调控的重要元件。要求是：应为强启动子；最好是诱导性的，如热诱导或化学诱导。2.转录终止子：一段终止RNA聚合酶转录的DNA序列。使转录终止，增强mRNA的稳定性，提高蛋白质产物的表达水平。3.核糖体结合位点：是指基因转录起始位点下游的一段DNA序列，即Shine-Dalgarno序列（简称SD序列）。4.筛选标记基因：微生物表型选择标记显性标记营养缺陷型标记在基因克隆中采用的质粒载体的选择标记，包括有新陈代谢特性、对大肠杆菌素E1的免疫性，
12、以及抗菌素抗性等多种5. 翻译起始密码子：起始密码子是翻译的起始位点，通常为AUG（ATG） ，编码甲硫氨酸（MET） ，是首选的起始密码子。也有极少数生物利用其它密码子作为翻译的起始位点，如GUG、UUG等。翻译终止密码子：翻译终止密码子与核糖体相遇时，能使核糖体从mRNA模板上脱落下来，终止蛋白质的翻译过程。影响线状双链DNA分子的电泳迁移距离的因素。1.分子量的大小: 迁移距离与分子量的常用对数成反比2. 凝胶浓度: 浓度越高，移动距离越短，适合分离低分子量DNA；浓度越低，移动距离越长，适合分离高分子量DNA；3.电压: 低电压时，迁移率与电压成正比；电压增高时，不同大小DNA片段迁移
13、率增大是不同的。4.碱基组成与温度: 不受影响,温度高可导致DNA带变形或解链。影响染色体DNA电泳的主要因素。1.DNA的分子大小及构型: 不同构型DNA的移动速度次序为：共价闭环DNA直线DNA开环的双链环状DNA。2.琼脂糖浓度： DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。3.DNA分子的构象4.嵌入染料的存在 5.电源电压：电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。电场强度不宜高于5V/cm。6. 离子强度影响：电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时,电导率最小,DNA几乎不移动。什么是生物芯片？生物芯片有哪些类型？生物芯片有何特点？1.生物芯片指一切采
14、用生物技术制备或应用于生物技术的微处理器。2.按载体材料分类：玻璃芯片、硅芯片、陶瓷芯片；按点样方式分类：原位合成芯片、微阵列芯片、电定位芯片；按芯片固定的生物分子类型分类：基因芯片、蛋白质芯片和芯片实验室；按芯片的使用功能分类:测序芯片、表达谱芯片、基因差异表达分析芯片。3.生物芯片主要特点是高通量、微型化和自动化。生物芯片的分类PCR的基本原理。类似于DNA 的体内复制。首先待扩增DNA 模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适
15、条件下的这种循环的不断重复。PCR反应体系有哪些成分？标准的 PCR反应体系：10扩增 缓冲液10ul；4种dNTP混合物各200umol/L；引物各10100pmol ；模板DNA0.12ug；TaqDNA聚合酶2.5u；Mg2+1.5mmol/；加双或三蒸水至100ul。大规模DNA测序中的随机测序策略指的是什么？随机测序战略又称鸟枪法策略，此策略是在一定作图信息基础上，绕过大片段连续克隆系的构建而直接将基因组分解成小片段随机测序，利用超级计算机进行组装。即将人类基因组DNA用机械方法随机切割成2Kb左右的小片段，把这些DNA片段装入适当载体，建立亚克隆文库，从中随机挑取克隆片段测序，最后
16、根据测序片段的重叠区域组装大片段DNA序列。什么是易错PCR法(Error-prone PCR) ？易错PCR是在采用DNA聚合酶进行目的基因扩增时，通过调整反应条件，来改变扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变，获得蛋白质分子的随机突变体。其关键在于对合适突变频率的选择，突变频率太高会导致绝大多数突变为有害突变，无法筛选到有益突变;突变频率太低则会导致文库中全是野生型群体。理想的碱基置换率和易错的最佳条件主要依赖于突变的DNA片段的长度。DNA诱变技术中的定点突变有哪些类型？1.寡核苷酸介导的基因突变指用含有突变碱基的寡聚核苷酸片断作为引物，在聚合酶的作用下启动DNA分子进行复制；2.盒式突变是利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应序列；3PCR介导的基因突变基因文库的质量标准有哪些？ 1.重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力；2.载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆；3.克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域；4.
