变性梯度凝胶电泳

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1、变性梯度凝胶电泳（DGGE）是一种根据 DNA 片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统。核酸的双螺旋结构在一定条件下可以解链，称之为变性。核酸 50%发生变性时的温度称为熔解温度（Tm ）。Tm 值主要取决于DNA 分子中 GC 含量的多少。DGGE 将凝胶设置在双重变性条件下：温度 5060 ，变性剂 0100%。当一双链 DNA 片段通过一变性剂浓度呈梯度增加的凝胶时，此片段迁移至某一点变性剂浓度恰好相当于此段DNA 的低熔点区的 Tm 值，此区便开始熔解，而高熔点区仍为双链。这种局部解链的 DNA 分子迁移率发生改变，达到分离的效果。Tm 的改变依赖于 DNA 序列，即使一个碱基的替代就可引

2、起 Tm 值的升高和降低。因此，DGGE 可以检测 DNA 分子中的任何一种单碱基的替代、移码突变以及少于 10 个碱基的缺失突变。详细 实验方法 变性梯度凝胶电泳(DGGE) 实验材料 DNA 样品试剂、试剂盒 尿素 去离子甲酰胺 丙烯酰胺 甲叉双丙烯酰胺 琼脂糖 仪器、耗材 PCR 扩增仪 变性梯度凝胶电泳仪 凝胶成像及分析系统 紫外透射仪 高速离心机 电泳仪 电泳槽 微量加样器 Tip 头 Tip 头盒 Eppendorf 管 Eppendorf 管架一、实验原理变性梯度凝胶电泳（DGGE）是一种根据 DNA 片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统。核酸的双螺旋结构在一定条件下可以解链，称之

3、为变性。核酸 50%发生变性时的温度称为熔解温度（Tm）。Tm 值主要取决于 DNA 分子中 GC 含量的多少。DGGE 将凝胶设置在双重变性条件下：温度 5060 ，变性剂 0100%。当一双链 DNA 片段通过一变性剂浓度呈梯度增加的凝胶时，此片段迁移至某一点变性剂浓度恰好相当于此段 DNA 的低熔点区的 Tm 值，此区便开始熔解，而高熔点区仍为双链。这种局部解链的 DNA 分子迁移率发生改变，达到分离的效果。Tm 的改变依赖于 DNA 序列，即使一个碱基的替代就可引起 Tm 值的升高和降低。因此，DGGE 可以检测 DNA 分子中的任何一种单碱基的替代、移码突变以及少于 10 个碱基的缺

4、失突变。为了提高 DGGE 的突变检出率，可以人为地加入一个高熔点区GC 夹。GC 夹（GC clamp）就是在一侧引物的 5端加上一个 3040bp 的 GC 结构，这样在 PCR 产物的一侧可产生一个高熔点区，使相应的感兴趣的序列处于低熔点区而便于分析。因此，DGGE 的突变检出率可提高到接近于 100%。作为一种突变检测技术，DGGE 具有如下的优点：（1 ）突变检出率高。DGGE 的突变检出率为 99%以上。（2）检测片段长度可达 1kb，尤其适用于 100500bp 的片段。（3）非同位素性。DGGE 不需同位素掺入，可避免同位素污染及对人体造成的伤害。（4）操作简便、快速。DGGE

5、 一般在 24 小时内即可获得结果。（5 ）重复性好。但是，该方法需要特殊的仪器，而且合成带 GC 夹的引物也比较昂贵。二、实验用品1PCR 扩增仪；变性梯度凝胶电泳仪；凝胶成像及分析系统；紫外透射仪；高速离心机；电泳仪；电泳槽。2尿素、去离子甲酰胺、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、琼脂糖3微量加样器（ 200l，20l）；Tip 头（200l，20l ）。Tip 头盒（200l，20l）；Eppendorf 管（0.5ml ，0.2ml），Eppendorf 管架。4PCR 扩增相关试剂三、实验步骤1PCR 反应（同前）其中，上游引物加 40bp GC Clamp。2PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳确

6、认。3垂直变性梯度凝胶电泳变性梯度递增的方向与电泳方向垂直。所使用的胶为 6%聚丙烯酰胺凝胶，变性浓度为 0 100%。其中，含 7 M 尿素和 40%去离子甲酰胺的胶为 100%变性，不含尿素和去离子甲酰胺的胶为 0%变性。垂直变性梯度凝胶电泳主要是检测引物的最适解链条件（即变性浓度）。PCR 产物加上样缓冲液后上样，300400l/孔，电压 150V，温度 60，时间 24 小时。4平行变性梯度凝胶电泳变性梯度递增的方向与电泳方向平行。根据垂直变性梯度凝胶电泳检测的解链区域的变性浓度，制备相应变性浓度的平行变性梯度凝胶，检测各标本是否存在突变。PCR 产物加上样缓冲液后，25l 30l/孔，电压 150V，温度 60，时间 36 小时。5染色 5 分钟，凝胶成像仪分析结果。四、注意事项1、该实验中提取 DNA，以及 DGGE 操作中接触到得很多药品都有毒，还有致癌、变性等毒害，一定要严格操作，做好防护保护自己。2、严格按操作步骤。