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1、 什么是凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA)？ 凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一种研究 DNA 结合蛋白和其相关的 DNA 结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究 DNA 结合蛋白，目前已用于研究 RNA 结合蛋白和特定的 RNA 序列的相互作用。 通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和 32P 同位素标记的DNA 或 RNA 探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双
2、链或者是单链。当检测 如转录调控因子一类的 DNA 结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。在检测 RNA 结合蛋白时，依据目的 RNA 结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的 DNA 或 RNA 片段和寡核苷酸片段（特异） ， 和其它非相关的片段（非特异） ，来确定 DNA 或 RNA 结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。EMSA 原理示意图如下： 凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA)常用的实验手段有同位素 32P 法和非同位素法（化学发光法） 。 一般做这样的实验
3、需要什么试剂？凝胶迁移实验需要的结合蛋白，可来源于纯化或部分纯化的蛋白，或粗的核和胞质抽提液。还必须制备同位素标记的 DNA 或 RNA。一般，DNA 核苷酸探针用 g-32P 和 T4 多核苷酸激酶来作末端标记，同位素标记的 RNA 用噬菌体 RNA 聚合酶和同位素标记的核苷酸在体外合成。结合反应所需的组分有：含盐的溶液（氯化镁，氯化钠，或氯化钾） 、缓冲体系（Tris-HCl 或 HEPES） 、还原剂（DTT） 、甘油、非特异的竞争 DNA（poly(dI:dC)(dI:dC)） ，也可能含非离子去污剂。在结合蛋白和同位素标记的探针作用后，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物，随后将凝
4、胶干燥并放射自显影， 或用 PhosphorImage 分析。 成功进行凝胶迁移实验，需要优化哪些因素？凝胶迁移实验在理论上很简单也很快速，但要成功地进行凝胶迁移实验，需要优化一些参数，这主要受结合蛋白的来源和探针结合位点特点的影响。以下是需要优化的因素：抽提液的制备（核酸酶和磷酸酶污染会使探针降解） ，结合蛋白的浓度，探针的浓度，非特异性探针的浓度，缓冲液的配方和 pH, 聚丙烯凝胶电泳的特点和电泳条件，保温时间和温度，载体蛋白， 是否有辅助因子（比如锌，或镉等金属离子，或激素） 。总之，反应总体积应最小（20uL） 。为满足一般要求，结合缓冲液含 4%甘油，1mM MgCl2, 0.5mM
5、 EDTA, 0.5mM DTT, 50mM NaCl, 10mM Tris-HCl(pH7.5), 0.05mg/mL poly(dI:dC)?dI:dC,或 10mM HEPES(pH7.9), 50mM KCl, 1mM DTT, 1mM EDTA, 10%甘油， 0.05mg/mL poly(dI:dC)?dI:dC 可作为优化实验的起始。 常用的同源的多核苷酸引物，这些引物的序列来源是什么？有各类 dsDNA 探针，它们含各种转录调控因子的同源结合位点。下表列出了所能提供的探针，和这些引物序列的出处。转录调控因子探针探针名 / 目录号 / 序列（上链） / 序列的出处Sp1 / E3
6、231 E3232 / 5-ATT CGA TCG GGG CGG GGC GCG-3 / SV40 启动子（1）AP1 / E3201 E3202 / 5-CGC TTG ATG AGT CAG CCG GAA-3 / 胶原酶基因 TRE（2）AP2 / E3211 E3212 / 5-GAT CGA ACT GAC CGC CCG CGG CCC GT-3 / 人金属硫堇 II a（3）基因 NF-kB / E3291 E3292 / 5-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3 / 鼠 Igk 轻链基因（4）Oct1 / E3241 E3242 / 5-TGT CG
7、A ATG CAA ATC ACT AGA A-3 / Ig 重链基因（5）CREB / E3281 E3282 / 5-AGA GAT TGC CTG ACG TCA GAC AGC TAG-3 / 大鼠生长激素抑制基因（6）TFIID / E3221 E3222 / 5-GCA GAG CAT ATA AGG TGA GGT AGG A-3 / belta-1 球蛋白启动子注：只列出了上链的序列，探针是双链，下链序列和上链序列配对。粗体字表明序列来源于指定的基因序列，转录调控因子结合的序列用下线表明。一般而言，周围的核苷酸是任意。 在 DNA 探针的选择上，要考虑哪些重要因素？目的 DNA
8、 的长度应小于 300bp，以有利于非结合探针和蛋白 DNA 复合物的电泳分离。双链的合成的寡核苷酸和限制性酶切片段可在凝胶迁移实验中用作探针。如目的蛋白已被鉴定，则应用短的寡核苷酸片段（约为 25bp）,这样结合位点可和其他因子的结合位点区别开。长的限制性酶切片段可用于对推定的启动子/增强子区域内的蛋白结合位点定位。随后可用 DNaseI 印迹对蛋白结合的特异区域在 DNA 序列水平上作出分析。 用以下一些转录调节因子和 HeLa 细胞核抽提物可形成哪些复合物：AP1, AP2, CREB, NFkB, Oct1, Sp1, TFIID, TFIIB?当用 HeLa 细胞核抽提物作为结合蛋白
9、的来源时，每 1 个转录调节因子和它相关的 DNA 同源序列结合形成特征型的结合形态。以下的文字描述了每一个单独的转录调节因子，包括识别的同源序列，因子的大小，特定的结合条件，以及和 HeLa 细胞核抽提物可形成的复合物的数目。 1AP1 ：AP1 （激活蛋白 1）是一个转录调节因子，它结合的同源序列为 5-TGAGTCA-3。当基因的启动子区域存在 AP1 的结合位点时，这些基因可以被诱导，比如用佛波酯可诱导蛋白激酶 C（2，7）。在细胞中，AP1 形成 c-Jun 或 Jun 相关蛋白的同聚双体，或者形成 c-Jun 或 Jun 相关蛋白和 c-Fos 或 Fos 相关抗原（Fras）的异
10、源双体。Fos 蛋白自身不能形成同聚双体，并不能单独和 AP1 结合位点结合。c-Jun 蛋白是一个40kDa 的单体蛋白并通过亮氨酸拉链形成同聚双体。在 HeLa 细胞中，AP1 的主要形式是 c-Jun 蛋白的同聚双体。在凝胶迁移实验中，形成一个特异的复合物。当作凝胶迁移实验测定 AP1 的活力时，除了基本的溶液组分外，应将 0.01mg/mL poly(dI:dC)(dI:dC),100ug BSA, 5mMDTT 加入到结合缓冲液中。如用纯化的蛋白，则用1-2ug 的蛋白来检测迁移复合物。 2AP2 ：AP2 是一个转录调节因子，可分别作为 TPA-和 cAMP 诱导因子（10）。它是
11、一个 52 kDa 的蛋白，识别的同源序列为 5-CCCCAGGC-3或 5-GCCNNGGC-3（3 ）。这个因子对视黄酸特别敏感，可能在形态发生中起着重要作用。HeLa 细胞核抽提物和 AP2 同源 DNA 探针形成一个特定的复合物。用纯化的蛋白作凝胶迁移实验时，应用 20-50ng 的蛋白。 3CREB：CREB 是一个 37 kDa 的转录调节因子，对 cAMP 应答，识别 5-T（G/T ）ACGTCA-3DNA 同源序列（6，11）。它含亮氨酸拉链结构而形成同聚双体，相关的基本结构域和 c-JunDNA 结合结构域同源。当用HeLa 细胞核抽提物时，能和 CREB 同源序列形成一个
12、复合物。 4NF-kB：NF-kB 最初被鉴定为在 B 细胞中和免疫球蛋白 k 轻链的增强子结合。但随后在非 B-细胞的细胞质中被发现，形成 NF-kB 和 IkB 的复合物。最初在 DNA 结合蛋白复合物中分离的 NF-kB 是由 p65(RelA)和 p50构成的异源双聚体。其他分离的单体包括 p49（也可称为 p52），p75 （c-Rel）,p68(RelB)。p65，p68，p75 单体起反式激活作用。p50，p49 （p52）单体具有 DNA 结合活力，但只具有微量的反式激活作用。据报道 p49 和 NF-kB 的单体 p65 形成具有转录活力的异源双体，类似于 p50/ p65
13、异源双体。p49/ p65 和 p50/ p65 异源双体在细胞质中受一种叫 IkBa/MAD-3 的抑制剂调节。IkB 和 p65 单体结合，阻制了细胞核中的定位和 DNA 的结合。在体外高浓度的 p65 能形成同源双聚体，能和 DNA 微弱地结合。Poly(dI:dC)能抑制这一反应（14）。p49 和 p50 也能形成同源双聚体，但在细胞中的浓度很低。通常，在作 NF-kB 的凝胶迁移实验时，在 20ul 的反应体积中，有溶于 10 mM HEPES 的 0.28pmoles 的 NF-kB9 寡核苷酸（pH7.9), 50mMKCl, 0.2mMEDTA, 2.5mM DTT, 10%
14、甘油, 0.05%NP-40。当用纯化的蛋白时，250-300ng 足以形成凝胶迁移复合物，而需用 10ug 的 HeLa 细胞核抽提物。凝胶迁移复合物在室温中保温 30 分钟，在50mMTris(pH8.3)和 38mM 甘氨酸的 7%聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离凝胶迁移复合物。含考马斯兰和二甲苯蓝色素的加样溶液只能加入到阴性对照反应中，因这两种色素会加剧 NF-kB 复合物的解离。当用 HeLa 细胞核抽提物作为结合蛋白来源时，可形成两种序列特异的凝胶迁移复合物，即 p50/p50 同源双聚体和 p50/ p65 异源双聚体。在表达 p49，p50 ，p65 的细胞中，可检测到 4 个序列特异
15、的凝胶迁移复合物（p49/ p49，p50/ p50，p50/ p65，p49/ p65），如果存在高浓度的 p65，可检测到微量的 p65/p65。下列试剂可加强 NF-kB在体外的结合：mM 的 GTP，ATP，精胺，亚精胺，钡或钙离子， ng 的 Co+3(NH3)6（12）。 5OCT1：OCT1 是 OCT 转录调节因子家簇中的一员，显然在哺乳细胞中存在比较广泛（5）。POU 结构域包括 POU-box 和 Homeo 结构域。当用 HeLa 细胞核抽提物时，可检测到一个与 OCT1 同源探针形成的序列同源凝胶迁移复合物。 6SP1 ：SP1 是一个 O-糖基化的转录调节因子，它识别
16、 10 个核苷酸长度的同源序列 5-GGGGCGGGGC-3（1）。核心识别序列是 5-GGGGCGGG-3。同核心序列相似的序列常存在于启动子中。SV40 的早期启动子就是一个例子，它是第一个可以结合 SP1 的启动子。根据糖基化的不同，它的分子量在 95-105kDa，DNA结合结构域中的三个锌指纹决定了序列的特异性。HeLa 细胞核抽提物与 SP1 同源探针形成特异的凝胶迁移复合物。 7TFIID/TFIIB：TFIID 和 TFIIB 是基本的转录调节因子，参与 RNA 聚合酶 II 启动子的基本的转录（16）。TFIID 与真核启动子的 TATA 区域形成特异的 DNA 结合。TFIID 由几个蛋白组成，而其中的 TATA 区域结合蛋白（TBP ），参与 TATA 序列的结合。TFIID 的其他的蛋白组分被称为 TBP-相关因子（TAFs ）。用 TFIID 探针寡核苷酸和 HeLa 细胞核抽提物，可得到一个微弱的凝胶迁移带，但很难确定为是 TFI
