《植物组织中丙二醛含量、蛋白质含量及过氧化物酶活力的测定》由会员分享，可在线阅读，更多相关《植物组织中丙二醛含量、蛋白质含量及过氧化物酶活力的测定（8页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、生物化学实验五植物组织中丙二醛含量、蛋白质含量及过氧化物酶活力的测定学生：吴潇潇 学号：0812134 指导老师：张芬琴（河西学院生命科学与工程系 08（1）班 甘肃张掖 734000）摘要：以三叶草和草坪草的叶片为材料，分别采用丙二醛法、考马斯蓝法及酶活力测定的方法对三叶草及草坪草叶片内丙二醛含量、蛋白质含量及过氧化物酶活力进行对比测定。实验结果表明：草坪草内丙二醛含量高于三叶草的，且都在 532nm 处吸光值最大；三叶草叶片内蛋白质含量高于草坪草叶片的；三叶草叶片中过氧化物酶活力大于草坪草叶片的。关键词：三叶草 草坪草 丙二醛含量 蛋白质含量 过氧化物酶活力 对比引言：丙二醛 (MDA)，
2、无 色 针 状 晶 体 ， 熔 点 72 74 ， 一 般 含 两 个 结 晶 水 ，60 下 真 空 干 燥 可 得 无 水 物 ， 易 潮 解 ， 纯 的 丙 二 醛 在 中 性 条 件 下 稳 定 ， 但 在酸 性 条 件 下 不 稳 定 。 由 乙 醛 和 甲 酸 乙 酯 在 碱 作 用 下 缩 合 而 得 ， 可 在 高 真 空 下升 华 精 制 ， 主 要 用 于 医 药 中 间 体 、 感 光 色 素 的 原 料 。 与 蛋 白 质 不 相 容 ， 有 潜在 的 致 癌 性 。 生 物 体 内 ， 自 由 基 作 用 于 脂 质 发 生 过 氧 化 反 应 ， 氧 化 终 产 物
3、 为丙 二 醛 ， 会 引 起 蛋 白 质 、 核 酸 等 生 命 大 分 子 的 交 联 聚 合 ， 且 具 有 细 胞 毒 性 。蛋 白 质 （ protein） 由 C、 H、 O、 N 组 成 ， 一 般 蛋 白 质 可 能 还 会 含 有P、 S、 Fe、 Zn、 Cu、 B、 Mn、 I 等 。 人 体 内 蛋 白 质 的 种 类 很 多 ， 性 质 、 功 能各 异 ， 都 是 由 20 种 标 准 氨 基 酸 按 不 同 比 例 组 合 而 成 的 ， 并 在 体 内 不 断 进 行代 谢 与 更 新 并 时 刻 处 于 动 态 平 衡 中 。酶 活 力 （ enzyme ac
4、tivity） 也 称 为 酶 活 性 ， 是 指 酶 催 化 一 定 化 学 反 应的 能 力 。 酶 活 力 的 大 小 可 用 在 一 定 条 件 下 ， 酶 催 化 某 一 化 学 反 应 的 速 度 来 表示 ， 酶 催 化 反 应 速 度 愈 大 ， 酶 活 力 愈 高 ， 反 之 活 力 愈 低 。 测 定 酶 活 力 实 际 就是 测 定 酶 促 反 应 的 速 度 。 酶 促 反 应 速 度 可 用 单 位 时 间 内 、 单 位 体 积 中 底 物 的减 少 量 或 产 物 的 增 加 量 来 表 示 。 在 一 般 的 酶 促 反 应 体 系 中 ， 底 物 往 往 是
5、过 量的 ， 测 定 初 速 度 时 ， 底 物 减 少 量 占 总 量 的 极 少 部 分 ， 不 易 准 确 检 测 ， 而 产 物则 是 从 无 到 有 ， 只 要 测 定 方 法 灵 敏 ， 就 可 准 确 测 定 。 因 此 一 般 以 测 定 产 物 的增 量 来 表 示 酶 促 反 应 速 度 较 为 合 适 .1.材料与方法1.1 材料采集及使用试剂1.11 材料采集：实验材料三叶草与草坪草分别取其叶片于自来水中冲洗，然后用吸水纸将水吸干待用。1.12 试剂：0.5%硫代巴比妥酸溶液 20%三氯乙酸（TCA） 1mg/ml 牛血清蛋白溶液 考马斯亮蓝溶液0.01mol/ml 磷
6、酸缓冲液 0.02mol/ml 愈创木酚 一定浓度过氧化氢溶液1.2 方法1.21 三叶草丙二醛提取：分别取 0.5 克三叶草与草坪草叶片于研钵中，加石英砂和 1ml 蒸馏水，研成匀浆，转移到试管中，再用 1.5ml 蒸馏水分两次洗研钵，合并提取液加入 2.5ml0.5%硫代巴比妥酸溶液, 摇匀沸水加热10min(自有气泡开始计时)，冷却至室温离心 15min 取上清液量其体积 V以0.5%硫代巴比妥酸溶液为空白对照分别测其在 450nm、532nm、600nm 下的吸光度。1.22 蛋白质含量的测定：如（1）制的提取液后，分别加入 5ml 缓冲液，再于 12000r/min 分离提取上清液，
7、并量上清液体积，用于蛋白质含量测定和酶活力测定。如下表配置好溶液后摇匀，5minhou 后以 1 号管为空白对照,在595nm 处测定 POD 值。表 1.221 溶液标准曲线的测定及溶液 OD 值 试管号 1 2 3 4 5 6 7 8100ug/ml 标准蛋白（ml）0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 样品（ ml）0.2 0.20.15mol/L NaCl （ml） 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.8考马斯亮蓝试剂 （ml） 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0A595nm 0. 0.137 0.288 0.360 0.524 0
8、.604 标 准 蛋 白 质 含 量 及 吸 光 值 曲 线00.1370.288 0.360.524 0.604y = 0.6076x + 0.01500.10.20.30.40.50.60.70 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2标 准 蛋 白 质 含 量吸光值图 1.221 标准蛋白质含量及吸光值曲线蛋 白 质 含 量 对 比 图2.430.6700.511.522.53三 叶 草 草 坪 草提 取 液蛋白质含量图 1.222 三叶草与草坪草蛋白质含量1.23 过 氧 化 物 酶 活 力 的 测 定 ： 如 表 1.231 所 示 读 取 470nm 处 吸 光 值 。 表 1.
9、231 溶 液 配 置 及 其 吸 光 值试 剂 对 照 管 样 品 （ 三 叶 草 ） 样 品 （ 草 坪 草 ）0.01mol/ml 磷酸缓冲液/ml 2.4 2.3 2.30.02mol/ml 愈创木酚/ml 0.5 0.5 0.5提取酶液/ml 0 0.1 0.1过氧化氢/ml 0.1 0.1 0.1混合后读出 OD 值，3min 后再读出 OD 值，作差OD 值差 0 0.927 0.2361.24SDS-PAGE 电泳实验步骤：1.241 安装夹心式垂直板电泳槽：目前，夹心式垂直板电泳槽有很多型号，虽然设置略有不同，但主要结构相同，且操作简单，不易泄漏。同学们可根据具体不同型号要求
10、进行操作。1.242 配胶：本实验采用 SDS-PAGE 不连续系统，按下表的配制分离胶和浓缩胶。表 1 不同浓度分离胶、浓缩胶的配制配制 20ml 不同浓度分离胶所需各种试剂/ml配制 10ml 浓缩胶所需试剂试剂名称5% 7.5% 10% 15% 3%分离胶贮液 （30%Acr-0.8%Bis)3.33 5.00 6.66 10.00 -分离胶缓冲液 （pH8.9Tris-HCl）2.50 2.50 2.50 2.50 -浓缩胶贮液 （10%Acr-0.5%Bis）- - - - 3.0浓缩胶缓冲液 （pH6.7 Tris-HCl）- - - - 1.2510% SDS 0.20 0.20
11、 0.20 0.20 0.101%TEMED 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00重蒸馏水 11.87 10.20 8.54 5.20 4.60混匀后，置真空干燥器中，抽气 10min10%AP 0.10 0.10 0.10 0.10 0.051.243 制备凝胶板：（1）分离胶制备：按表配制 20ml 10%分离胶，混匀后用细长头滴管将凝胶液加至长、短玻璃板间的缝隙内，约 8cm 高，用 1ml 注射器取少许蒸馏水，沿长玻璃板板壁缓慢注入，约 34mm 高，以进行水封。约 30min 后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合。倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多
12、余水分。（2）浓缩胶的制备：按表配制 10ml 3%浓缩胶，混匀后用细长头滴管将浓缩胶加到已聚合的分离胶上方，直至距离短玻璃板上缘约 0.5cm 处，轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内，避免带入气泡。约 30min 后凝胶聚合，再放置 2030min。待凝胶凝固，小心拔去样品槽模板，用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的水分，将 pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液倒入上、下贮槽中，应没过短板约 0.5cm 以上，即可准备加样。 1.244 样品处理及加样各标准蛋白及待测蛋白都用样品溶解液溶解，使浓度为 0.51mg/mL，沸水浴加热 3 分钟，冷却至室温备用。处理好的样品液如经长期存放，使用前应在沸水浴中加
13、热 1 分钟，以消除亚稳态聚合。一般加样体积为 1015L（即 210g 蛋白质） 。如样品较稀，可增加加样体积。用微量注射器小心将样品通过缓冲液加到凝胶凹形样品槽底部，待所有凹形样品槽内都加了样品，即可开始电泳。1.245 电泳将直流稳压电泳仪开关打开，开始时将电流调至 10mA。待样品进入分离较时，将电流调至 2030 mA。当蓝色染料迁移至底部时，将电流调回到零，关闭电源。拔掉固定板，取出玻璃板，用刀片轻轻将一块玻璃撬开移去，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色。1.246 染色及脱色将染色液倒入培养皿中，染色 1h 左右，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白区带清
14、晰，脱色后立即拍照。用直尺分别量取各条带与凝胶顶端的距离。1.25 SDS-PAGE 电泳图 1 蛋白质电泳图谱图 2 POD 同工酶电泳图谱2.结果与分析1.21 结果分析：532 nm 处测得吸光值最大；草坪草叶片内的丙二醛含量高于三叶草的。因为草坪草机体内纤维素含量远大于三叶草的而且丙二醛在酸性和高温条件下，可以与硫代巴比妥酸反应生成红棕色的三甲川，其最大吸收波长在532 nm。1.22 结果分析：由图 1.222 可见，三叶草中蛋白含量大于草坪草的，原因可能是叶是光合作用、呼吸作用的主要器官。宽大肥厚的三叶草叶片比窄而薄的草坪草叶片易合成并储存蛋白质。酶 活 力 对 比0.1270.1
15、170.1120.1140.1160.1180.120.1220.1240.1260.128三 叶 草 草 坪 草提 取 液酶活力图 1.231 三叶草与草坪草酶活力1.23 由图 1.231 可见，三叶草中过氧化物酶活力大于草坪草的，原因可能是三叶草的蛋白质含量高于草坪草的。1.25 结果分析：蛋白质电泳图谱对比可看出，三叶草蛋白质迁移率比草坪草蛋白质迁移率高，说明三叶草中蛋白质含量比草坪草中蛋白质含量高。POD 同工酶电泳图谱对比可看出，三叶草 POD 同工酶电泳条带比草坪草的多，由此表明三叶草容易受低温环境的影响。3.讨论三叶草属于蝶形花科，草坪草属于草本科，它们是两个不同科的植物。叶草叶片中丙二醛含量高于草坪草含量，由此可以说明三叶草叶片的膜脂过氧化程度比草坪草的高，其抗低温的能力较弱。三叶草中蛋白含量大于草坪草的，由此可以说明宽大肥厚的三叶草叶片比窄而薄的草坪草叶片易合成并储存蛋白质。过氧
