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1、食品与蛋白质工程,概述,蛋白质是对生命至关重要的一类生物大分子物质，各种生命功能、生命现象、生命活动都和蛋白质有关。在生命有机体催化、运动、结构、识别和调节等许多方面，起着关键的作用。,酶.几乎全都是蛋白质。肌肉收缩、精子移动、细胞分裂过程中的染色体移动.高等生物的有序生长和分化过程。抗体蛋白能识别和结合特异性的外源物质，使人体具备抵抗各种细菌、真菌和病毒的能力。由神经细胞膜蛋白构成的离子通道，负责神经冲动的形成和传导。血红蛋白具有结合和释放氧的能力，是血液中氧、二氧化碳和氢离子的携带者。另外，人体的毛发和指甲属于角蛋白，而血栓是由血纤蛋白单体聚合而成的。,蛋白质的生物学功能,1.催化功能：酶
2、2.调节功能：激素3.结构功能：皮、毛、骨、牙、细胞骨架4.运输功能：血红蛋白5.免疫功能：免疫球蛋白6.运动功能：鞭毛、肌肉蛋白7.储藏功能：酪蛋白8.生物膜功能：及神经传导等,蛋白质是生命的体现者，离开了蛋白质，生命将不复存在。可是，生物体内存在的天然蛋白质，有的往往不尽人意，需要进行改造。由于蛋白质是由许多氨基酸按一定顺序连接而成的，每一种蛋白质有自己独特的氨基酸顺序，所以改变其中关键的氨基酸就能改变蛋白质的性质。而氨基酸是由三联体密码决定的，只要改变构成遗传密码的一个或两个碱基就能达到改造蛋白质的目的。蛋白质工程的一个重要途径就是根据人们的需要，对负责编码某种蛋白质的基因重新进行设计，
3、使合成的蛋白质变得更符合人类的需要。,第一节 概述,一、蛋白质工程的涵义 1.狭义：指通过改造与蛋白质相应的基因中的碱基顺序，或设计合成新的基因，将它克隆至受体细胞中，通过基因表达而获得具有新的特性的蛋白质（酶）技术。 2.广义：P56这是一门从改变基因入手，定做新的蛋白质的技术。故有人将其称为“第二代基因工程”1983年，美国生物学家额尔默（Ulmer）首先提出了“蛋白质工程”的概念。,根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质；确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系；从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生物功能，设计合成具有特定生物功能的全新蛋白质。,二、蛋白质工程研究的主要
4、内容,三、理性分子设计和非理性分子设计,1.理性分子设计： 在已知蛋白质结构与功能的基础上，利用改变基因中某个或某些特定核苷酸的序列，对最可能影响蛋白质功能与性质的基因序列进行定位突变，有目的地改变蛋白质的某一两个氨基酸残基或模块，从而构建全新的蛋白质分子的技术。（P57）,2.非理性分子设计：在不清楚蛋白质三维结构和作用机制的情况下，在实验室条件下模拟自然进化的过程，在一定条件下使基因发生大量变异，然后通过多轮高通量的筛选方法定向选择出所需要的特性突变我，得到具有预期新蛋白质的技术。（P57）,四、蛋白质工程的应用,1.提高酶的稳定性2.提高酶的活力3.改变酶的选择性,改变酶的催化活性,酪氨
5、酰tRNA合成酶,改造,活力,25倍,改变酶的专一性,Cys,改造,通过引入“工程二硫键”稳定溶菌酶构成活性中心的两个结构域的相对位置，增强酶的稳定性；定位突变提高其半衰期。采用盒式突变使葡萄糖异构酶分子中酸性氨基酸集中区域用碱性氨基酸替代，从而改变酶作用的最适pH环境。,干扰素是一种抗病毒、抗肿瘤的药物。将人的干扰素的cDNA在大肠杆菌中进行表达，产生的干扰素的抗病毒活性为106 U/mg，只相当于天然产品的十分之一，虽然在大肠杆菌中合成的-干扰素量很多，但多数是以无活性的二聚体形式存在。为什么会这样？如何改变这种状况？研究发现，-干扰素蛋白质中有3个半胱氨酸（第17位、31位和141位），
6、推测可能是有一个或几个半胱氨酸形成了不正确的二硫键。研究人员将第17位的半胱氨酸，通过基因定点突变改变成丝氨酸，结果使大肠杆菌中生产的-干扰素的抗病性活性提高到108 U/mg，并且比天然-干扰素的贮存稳定性高很多。,第二节 理性分子设计和定位突变技术,一、理性分子设计的主要步骤：（1）从生物体中分离纯化目的蛋白；（2）测定其氨基酸序列；（3）借助核磁共振和X射线晶体衍射等手段，尽可能地了解蛋白质的二维重组和三维晶体结构;,（4）设计各种处理条件，了解蛋白质的结构变化，包括折叠与去折叠等对其活性与功能的影响；（5）设计编码该蛋白的基因改造方案，如点突变；（6）分离、纯化新蛋白，功能检测后投入实
7、际使用。,二、定位突变,定位突变：在已知蛋白质结构与功能的基础上，在已知DNA序列中取代、插入或删除特定的核苷酸，从而产生具有新性状的蛋白质分子的一种蛋白质工程技术。,三、定位突变在酶结构改造中的应用,（一）淀粉酶B. licheniformmis -淀粉酶的双突变体 A209V/H133T，酶在 90的半衰期延长了 9 倍。Mitchinson 等人用定点突变和高通量筛选的方法得到了一个突变体，其最适 pH 值提高了 0.51.0。Gloria 等人用 Phe 或 Tyr 来替B.stearothermophilus -淀粉酶 289 位的 Ala，其具有了催化醇化反应的能力。Sierks
8、等人报道了通过改变葡萄糖淀粉酶活性位点的三个氨基酸残基，其作用于 1,4-糖苷键相对于 1,6-糖苷键的 Kcat/Km比值提高了300 倍。,（二）蛋白酶枯草杆菌蛋白酶活性位点内有一个Met残基，利用定位突变技术用Cys代替Met可增加该蛋白酶的活力。用不可氧化氨基酸（Ser、Ala、Len）构造的枯草杆菌蛋白酶能抗氧化，不易失活。,（三）纤维素酶,Hakamada 等人用定点突变的方法将细菌碱性纤维素酶的 Glu137、Asn179和 Asp194 突变为 Lys，其热稳定性得到了提高。Zhang 等人专门研究了 T.fusca 纤维素酶 Ce16A表面残基对底物专一性的影响，发觉突变体
9、R237A 对羧甲基纤维素的活力提高了。后来他又研究了靠近活性位点残基对催化活性、底物专一性、配基连接亲和性的影响，4 个残基（His159、Arg237、 Lys259、Glu263）的 7 个突变体对羧甲基纤维素的活性都有所提高，其中 K259H 突变体的活性提高的最为显著。,在高温下Asn和Gln容易脱氨形成Asp和Glu，而导致蛋白质分子构象的改变，使蛋白质失去活性。对酿酒酵母的磷酸丙糖异构酶进行诱变改造。这种酶有两个相同的亚基，每个亚基含有2个Asn，由于它们都位于亚基之间的界面上，可能对酶的热稳定性起决定性作用。通过寡核苷酸介导的定向诱变技术，将第14位和第78位上的2个Asn分别
10、转变成Thr(苏氨酸)和Ile(异亮氨酸)残基，大幅度提高突变酶的热稳定性。,转化氨基酸残基，改善蛋白质热稳定性,改变酶的最适pH值条件,葡萄糖异构酶最适pH为碱性，在80稳定，而在碱性条件下， 80时使高果糖浆焦化产生有害物质，反应只能在60进行。采用盒式突变技术将葡萄糖异构酶分子中酸性氨基酸(Glu或Asp)集中的区域置换为碱性氨基酸(Arg或Lys)，可使葡萄糖异构酶的最适pH值变为酸性，即可在高温下进行反应,提高酶的催化活性,酶的催化活性由酶分子上的必需基团决定如对酪氨酸-tRNA合成酶进行定点突变在天然状态下，酪氨酸-tRNA合成酶分子内第51位苏氨酸残基的羟基能与底物酪氨酰腺嘌呤核
11、苷酸戊糖环上的氧原子形成氢键，这个氢键的存在影响酶分子与另一底物ATP的亲和力。因此，利用定向诱变技术将酶分子第51位苏氨酸残基改变为脯氨酸残基，酶(Pro-51)与ATP的亲和力被增加了近100倍，而且最大反应速度亦大幅度提高。,修饰酶的催化特异性 利用定点突变技术葡萄糖淀粉酶的催化特性。如将活性中心的GLu、Asp被Gln、Asn取代时，突变体酶分解-1，4糖苷键和-1，4糖苷键的活性比例发生明显改变,修饰Nisin的生物防腐效应 Nisin是乳酸球菌分泌的有较强抗菌作用的小分子肽，可用于罐头食品、乳制品、肉制品的保藏Nisin由34个氨基酸残基构成,改变Nisin氨基酸的序列，可增强其稳
12、定性、溶解度和扩大抑菌谱等，扩大Nisin的应用范围。,Nisin分子结构中包含5种稀有氨基酸，即ABA、DHA、DHB、ALA-S-ALA和ALA-S-ABA，它们通过硫醚键形成五个内环。,蛋白质在风味修饰蛋白方面的应用,1、物理改性2、化学改性（1）碱处理 （2）酸处理（3）琥珀酰化作用 （4）乙酰化作用（5）磷酸化作用 （6）酰胺化作用（7）硫醇化作用 （8）酯化作用（9）糖酰化作用 （10）去酰胺基作用,融合蛋白技术：通过DNA重组技术将两个基因重组从而构建和表达多功能新型蛋白质的技术。 融合蛋白：通过DNA重组技术得到的两个基因重组后的表达产物。,融合蛋白技术及其应用,融合蛋白技术的
13、应用,双功能酶： -半乳糖苷酶-半乳糖脱氢酶融合蛋白在一定条件下，其偶联反应产生 NADH 的速度是同时加入这两种酶的反应速度的两倍以上。同时过渡态时间缩短近四倍。靶向药物： 定向药物一般由两部分组成：一部分是药物；另一部分是可以与病灶特异性结合的配基。通过融合蛋白技术将这两部分融合在一起， 即可构成一个具有独特构象与功能的蛋白质。 例： 胸腺素/干扰素融合蛋白用于乙型肝炎等的治疗。抗菌肽： 例：抗菌肽B和人溶菌酶的融合蛋白，可抑制HIV病毒。,食物蛋白改性技术,化学改性：针对蛋白质的氨基、羟基及羧基进行化学修饰改变蛋白质的结构、静电荷、疏水基团，而起到改变蛋白质功能性质的目的。酰化磷酸化羟甲基化磺酸化化学接枝共价交联水解及氧化等,例：通过干热美拉德反应使卵清蛋白与葡聚糖发生交联，形成蛋白/多糖共价复合物（PPC）。具有极高的表面活性，可作为优质乳化剂。,酶法水解改性酶法聚合改性物理改性,本章思考题,1.什么叫蛋白质工程？2.试述蛋白质工程在食品工业中的应用。,
