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1、PLFA 方法分为三个步骤，分别是提取、分离和甲酯化（1）提取：称 2 g 干土加入 4 mL 柠檬酸缓冲液（0.15 mol/L 二水柠檬酸三钠，0.15 mol/L 柠檬酸） ，5 mL 氯仿，10 mL 甲醇（柠檬酸缓冲液 氯仿甲醇=0.812） ，轻微涡旋震荡 30 s，超声处理 2 min，25 避光震荡 2 h，4000 r/min离心 10 min，将上清液转移到一个新的离心管中，重复操作取上清液（重复取的上清液放置于一个新的 40 mL 的离心管中） 。每个离心管中各加入 5 mL 柠檬酸缓冲液和 5 mL 氯仿（柠檬酸缓冲液 氯仿甲醇=0.9:1:1） ，震荡过夜，2500
2、rpm离心 20 min。经过夜分离后，吸走上层（大约 2/3）保留底层氯仿相，过处理定量滤纸（氯仿和甲醇混合液（2:1，V/V）浸泡处理） ，二者合并，在氮气流下吹干氯仿或者旋转蒸发（温度低于 35 ） 。（2）分离：用 0.5 mL 氯仿溶解，将氯仿加到硅胶柱顶部，过填充有活化硅胶（使用丙酮索氏提取硅胶 6-8 h，120 活化 2 h）的玻璃管柱（高 100 mm，直径 6 mm） ，然后依次分别加入 42.5 mL 氯仿、42.5 mL 丙酮、42.5 mL甲醇（每次溶剂加入后自然洗脱至无液滴自然流下时真空抽干） ，收集甲醇相在氮气流下吹干。（3）甲脂化：向吹干样品中加入 1 mL 甲
3、醇甲苯（1:1）和 1 mL 0.2mol/LKOH 甲醇溶液（新鲜配制，甲醇不含水） ，手动摇晃 1 min，放入水浴 3536温浴 15 min，后冷却到室温，依次加入 2 mL 去离子水，0.3 mL 1 mol/LHAc，2 mL 正己烷，漩涡混合 30 s，然后 3000 r/min 离心 10 min，重复提取（仅添加正己烷）一次，合并两次提取的正己烷相，加入甲脂化的 C19:0 为内标，氮气流下吹干或者旋转蒸发，-20 冷冻保存，在上机测定前用 100 L 正己烷（色谱纯）定容待测。采用气质联用仪测定 PLFAs，包括 Agilent6890N 型气相色谱仪，5975C 质谱检测
4、器，HP-5MS 5%石英毛细管柱（30.0 m250 m0.25 m） 。色谱条件如下所示：载气为氦气（He） ；流量 1.0 mL/min；不分流进样；进样口温度 250，检测器温度 250 ，接口温度 280 ，四级杆温度 150 ，离子源温度 230，EI 源 70 eV；质谱全扫描范围： 50-500 amu，溶剂延迟 3 min。升温程序为，初始温度 80 ，以 30 /min 升到 150 ，再以 3 /min 升至 230 ，保持 1min，再以 10 /.min 升至 280 ，保持 2 min，总用时 37.00 min；PLFA 法的命名一般采用以下原则，以总碳数:双键数和双键距离分子末端位置命名，c 表示直链顺单烯，t 表示直链反单烯， a 和 i 分别表示支链的反异构和异构，10 Me 表示一个甲基团在距分子末端第 10 个碳原子上，cy 表示环丙烷脂肪酸。不同的微生物具有不同的 PLFA 种类，因此 PLFA 可以作为环境中微生物种类组成的指标。如可用 i15：0、a15：0、17：0、cy17：0、17：18c、18：17c、
