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1、聚焦 3D细胞培养，3D 培养系列产品综合介绍引言在细胞和组织培养领域，从上世纪 70年代起 2维（2D）培养的局限性和 3维（3D）培养的优点引来诸多关注，越来越多的研究希望将细胞从平面环境中转变到 3D空间来。当前，虽然对基于细胞的效应研究和毒性测试中，制药工业如今最常用的依旧是 2D方式，3D 培养技术已在学术研究中被广泛应用。随着在生物相关性，通量，产出量等方面的改进，伴随3D培养成本的降低，3D 培养在再生医学，基础研究和药物研发中的应用将越来越广泛，一场细胞由 2D培养走向 3D的变革正在发生。2D细胞培养的局限性与 3D培养的优势细胞增殖，分化和代谢等生理活动都严重受到微环境的影
2、响。当前细胞生物学研究大多还是在二维平面培养进行，这种平面培养、生长方式与机体内立体环境差别很大，导致细胞形态、分化、细胞与基质间的相互作用以及细胞与细胞间的相互作用与体内生理条件下细胞的行为存在明显差异。2D 和 3D环境下培养的细胞相比较，诸多生理指标都显著不同，例如原代小鼠乳腺管腔上皮细胞(mammary luminal epithelial cells, MEC)在 3D基底膜基质中增殖的时间明显长于 2D培养环境；更有甚者，有时药物作用于 2D培养的细胞呈现的效应与 3D细胞相反。3D 培养可以设计模拟体内的生理环境，让细胞在生理行为上与机体实际的生理环境更接近。正因为此，很多药物研
3、发企业和护肤品生产企业更倾向于使用3D培养细胞（或组织类似物）来开展实验、研究：3D 培养让药物研发企业相当程度上摆脱了伦理 3R对动物实验的约束，缩短了研发周期，提高了结果可信度，研发少走了弯路，从而节省了成本，提高了企业的竞争力。可以预见，未来在高通量，自动化，低成本，广应用性和高预测性等方面 3D培养将逐步突破并日趋成熟、完善，2D 培养向 3D的转变成为必然的发展趋势和时代潮流。3D细胞培养的主要类型当前市场上有多种类型的 3D培养系统，根据产品是否为细胞提供支撑（支架）材料（scaffold）大体可分为两种类型：基于 scaffold的培养体系和无 scaffold的培养体系。Sca
4、ffold则又有天然成分和人工合成成分之分。一、无 scaffold的培养体系没有供细胞粘附、生长和扩散的支撑结构，使培养基中的细胞聚集成为类似于组织的微组织球体（microtissue spheroids）。无 scaffold的培养体系可通过悬滴（hanging drops）让细胞在重力的作用下通过自组装形成微球体。这种方法的优点是可以通过控制悬滴而精准的控制微组织球，使其具有高一致性，为后续研究提供好的微组织材料。而且通过悬滴法可以实现对不同细胞类型的共培养，保证共培养细胞间的信息交流。无 scaffold的培养悬滴培养体系的代表性厂家为 InSphero，他们的 96孔板设计可以通过手
5、动操作，也支持自动化上样装置轻松实现微组织培养，在肿瘤研究和新型抗癌药物筛选等领域中被广泛选用。下面对 InSphero的悬滴培养技术做一简要介绍：3D细胞培养板主要由 GravityPlus板和 GravityTRAP板组成，如下图： GravityPlus 板：采用细胞悬滴法（专利技术），使细胞形成球体状微组织（3D 状态）；将细胞悬液（一种细胞或多种细胞）添加到 GravityPlus板中，2-4 天，细胞在GravityPlus板中会形成微组织（微球状）；GravityTRAP 板：采用非粘附包被技术，使微组织在无依附、不解聚情况下培养数周，便于后续实验及检测。当微组织形成后，将其转移
6、到 GravityTRAP板中，可使微组织在无依附、不解聚情况下培养数周，便于后续实验及检测。InSphero无介质支架(scaffold-free) 培养形成的 3D微组织呈多细胞球状体，无论在形态学上，还是在功能上均与自然组织类似。适用于标准的生物化学检测和免疫染色等处理。以便捷的 96孔板内 3D培养模式提供，在多种临床前检测中被广泛应用。紧密的细胞间连接，与体内类似的基因表达谱、营养和氧梯度等使 3D微组织成为体外细胞实验的理想模式。如今，全球最大的前 15家制药和护肤品企业均在使用 InSphero的 GravityPLUS平台及 3D微组织。另一代表性厂家是为 N3D Biosci
7、ences，下面对 N3D Biosciences的磁力驱动 3D细胞培养做一简要介绍：美国 n3D Biosciences,Inc 以磁化细胞培养技术为基础，研发出一系列磁力驱动 3D细胞培养产品。磁化细胞培养技术：以 NanoShuttle（一种生物相容性磁性纳米颗粒）为中心，将其加入到细胞或培养基中磁化细胞，然后再使用磁力驱动器，就可以让细胞进入磁悬浮状态或将细胞打印（printing）成具有结构和生物性能的典型 3D模型（环状或微球状）。 对于 96孔板试剂盒来说，磁力驱动器有两种：Dot 磁力驱动器和 Ring磁力驱动器，根据培养的细胞类型和应用来选择： n3D Bioscience
8、s辅助产品：Magpen（磁力笔），可用于转移 3D微组织或者是用于多细胞分层共培养 其它无 scaffold产品还有：3D Biomatrix 公司的 Perfecta3D悬滴板通过悬滴技术实现微组织培养。InfiniteBio 公司 SCIVAX 3D产品，其 NanoCulture Plate (NCP)为合成聚合物(synthetic polymer)材料，具有超低粘附力的微板结构表面，细胞在此微结构上迁徙、相互粘附形成微球体。BioLevitator 应用磁性微球载体，整合 3D和微载体培养技术实现高密度 3D细胞培养；microtissues 的 3D petri Dish通过琼脂
9、界面进行 3D培养等。二、基于 scaffold的培养体系1. 根据支持物的性质分类，基于 scaffold的培养体系可分为天然细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）作为支持材料的 3D培养和人造基质作为支持材料的 3D培养。（1）天然 ECM作为支持材料的 3D培养这种方法以天然 ECM作为支持材料，根据培养细胞类型，优化 3D培养基质配方，以满足不同组织细胞的培养需求。很多公司都可提供细胞外基质产品用于 3D培养，例如 TAP Biosystems（已被 Sartorius Stedim Biotech收购）的 RAFT胶原系统，Matrigel 模拟基底膜基质产品
10、；Advanced BioMatrix，Amsbio 和 Sigma-Aldrich公司也都有细胞外基质凝胶产品。但天然基质材料存在一定病原风险，且材料可能存在批次差别性等缺点。（2）人造基质作为支持材料的 3D培养方法合成的人造基质材料类型相当多，例如 Cellendes的 3D Life仿生水凝胶材料；3D Biotek公司有多种 3D大分子支架材料；Reinnervate 公司 Alvetex产品用的是聚苯乙烯(polystyrene scaffold)；Life Tech 公司的 AlgiMatrix 3D培养系统采用褐藻原料；Synthecon和 Xanofi的纳米纤维技术平台 Xa
11、noMatrix采用合成纳米生物基质和培养材料；PuraMatrix采用合成肽水凝胶；其它合成材料产品还包括 Lena Biosciences的 SeedEZ等。Cellendes的 3D Life仿生水凝胶材料可以说是合成的人造基质材料的优秀代表。Cellendes的 3D Life仿生水凝胶通过合成大分子材料和交联剂(crosslinker)方式和比例的灵活组合，构建不同的 3D细胞培养环境。这种高化学和机械柔性（flexibility）的合成系统赋予了该材料较动物源性支持材料更多的优势。诸多优点使 3D Life仿生水凝胶不但是普通 3D培养的上佳选项，也使其成为细胞扩散和迁移研究的理想
12、产品。下文对 Cellendes的 3D Life Biomimetic Hydrogel System做一简单介绍：3D life仿生水凝胶系统与活体细胞外基质类似，可使体外细胞培养更接近体内的生理特征，是基础研究、药物筛选和再生医学等领域的理想选择。这类产品的优点主要体现在如下三个方面：A)产品组合灵活。B)操作简单，控制自如。C)应用范围广泛：可用于细胞培养、标记和显微观察等诸多方面；细胞可在凝胶内也可在凝胶表面培养；可活细胞直接观察也可选择原位固定后观察；支持 GFP等多种报告基因标记后观察方式；可选择不同类型细胞共培养，更好模拟体内生理状态。3D life主要有两种水凝胶：PEG-L
13、ink 交联形成的水凝胶和 CD-Link交联形成的水凝胶：细胞在 PEG-Link交联形成的水凝胶中培养细胞可以通过单细胞或是细胞团的形式埋在 PEG-Link为交联剂的水凝胶中，根据细胞类型不同，形成上皮样囊结构，微球体或是克隆。可以根据需要考虑为生成特定的表型而添加相应的细胞粘附因子。细胞不能在这种水凝胶中迁移扩散。细胞在 CD-Link交联形成的水凝胶中培养细胞可以通过单细胞或是细胞团的形式埋在 CD-Link为交联剂的水凝胶中，培养的细胞如产生相应的细胞外基质金属蛋白酶则能将临近的基质交联剂切割。在添加相应粘附因子基序下，细胞诱导细胞扩散和迁移。3D life水凝胶中细胞的固定与标记
14、使用小分子物质，例如荧光标记 phalloidin，核酸染料，活性和毒性检测试剂，增值检测试剂等小分子物质进行细胞标记方法，除了在孵育时间上适度延长以便能在水凝胶中充分扩散外，与传统的 2D细胞培养方式相同。所培养的细胞如果经基因修饰还有荧光蛋白，则可直接用于观测，因凝胶完全透明不影响观测结果。如果使用抗体等大分子对细胞进行标记则不能直接在水凝胶中开展，因水凝胶的孔径原因，不适合直接抗体标记，需要使用dextranase将细胞从水凝胶中释放出来，如果担心细胞在操作过程中细胞生理活动波动，则可经在凝胶中将细胞固定后在进行操作。2. 如果按支持材料形成的方式分，基于 scaffold的培养体系可分
15、为如下两类，一种是将细胞分散在液体水凝胶中，然后通过交联实现 3D培养，这类产品代表生产商包括Cellendes, Matrigel, Glycosan Biosystems和 QGel等；另外一种是将细胞“播种在 3D基质上，这类方法的代表厂商包括 3D Biotek, Alvetex和 AlgiMatrix等。第一种方式中的 Cellendes产品上面已经做了简要介绍；下面将细胞“播种在 3D基质方法的代表产品3D Biotek给予简要介绍：3D Biotek得益于其精妙的 3D微细加工技术和先进的生物制造工艺，产品在干细胞/组织工程、药物研发和细胞生物应用等涉及 3D培养的领域处于引领地
16、位。根据用户的不同需求，3D Biotek 提供系列的产品和装置，包括多种 3D细胞培养的支架材料：例如可生物降解的聚已内酯 3D Insert PCL，这种材料已经被美国标准和技术协会(NIST)认定为标准的 3D组织培养支架材料；聚苯乙烯 3D Insert PS材料。 3D Biotek开发有独有的可直接用于如细胞凋亡和荧光 ELISA等荧光和化学发光实验的新材料培养板。3D Biotek还提供可降解生物材料 Poly(DL-lactide-co-glycolide) (PDLLGA)。3D Biotek有用于 3D肿瘤细胞或干细胞培养(或共培养)的仿生基底膜：3D Insert-PS/PCL (聚苯乙烯/聚已内酯)纳米筛网。高效将质粒转染入 3D培养的细胞的 3D转染试剂盒(BioCellChallenge, SAS)。多种 3D Biotek专利技术制造多孔聚合物支架材料填充的 3D生物发生器（3D Bioreactor），即包括可生物降解聚合物(polystyrene, PS)也包括不能生物降解聚合物(polyca
