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1、农业仪器权威门户 http:/ 11 号 联系电话：0571-81953317 http:/ 1946 年瑞典物理化学家 Tiselius 教授研制的第一台商品化移界电泳系统问世以来, 在近半个多世纪的时间里,电泳技术发展极其迅速。基于电泳原理的各种仪器设备不断问世 ,特别是 20 世纪 80 年代后, 许多自动化电泳仪器相继为临床实验室所采用,电泳技术已成为基础医学和临床医学研究的重要工具之一。 目前,该技术已广泛用于蛋白质、多肽、氨基酸、核苷酸、有机物、无机离子等的分离和鉴定,甚至病毒与细胞的研究。特别是电泳所用支持介质由流动相改为固相支持物后,各种各样的电泳分析装置不断推出以适应不同教学
2、、临床和科研工作的需要。当今,电泳技术与质谱技术联用在后基因组学研究中 ,正发挥者着巨大的作用,为临床检验的发展带来新的生机与活力。 一、电泳分析仪 电泳分析仪可分为两大类:临床实验室常规类,如全自动荧光 /可见光双系统电泳仪、全自动醋纤膜电泳仪、全自动琼脂糖电泳仪和全自动琼脂糖电泳仪;科研为主兼做临床样本类,如双向电泳及双向电泳 2 液相色谱 2 质谱联用、高效毛细管电泳及高效毛细管电泳 2 质谱联用、高效毛细管芯片电泳、DNA 测序系统。 1. 全自动荧光/可见光双系统电泳仪:具有荧光/可见光双系统,在使用荧光试剂项目如肌酸激酶(CK) 、乳酸脱氢酶 (LD)同工酶时为全自动。只需将样品、
3、试剂、琼脂糖凝胶电泳胶片放好后,操作人员可离机完成试验并得到结果,此为全自动电泳仪。但是使用可见光项目如蛋白电泳,中途人员需返回,将电泳胶片由电泳槽放入染色系统中才可完成试验。而最大优点是荧光系统全自动且灵敏度高,准确度高并且采用高压、低温系统 ,只需要 20 min 即可完成电泳分析,速度非常快。 2. 全自动醋纤膜电泳仪:为可见光单系统 ,使用醋纤膜电泳片。自动化程度高,只需将样品、试剂、电泳片放好,人员可离机完成试验得到结果。但是因为使用醋纤膜致使灵敏度低 ,无法分析尿蛋白/脑脊液蛋白,对同工酶分析效果也不理想,多半实验室只用于血清蛋白电泳分析。3. 全自动琼脂糖电泳仪:为可见光单系统
4、,使用琼脂糖凝胶电泳胶片。优点为灵敏度高,可使用于低浓度蛋白检验,如尿蛋白及脑脊液蛋白。而同工酶的分离效果也相当不错。但缺点为自动化程度较差,当电泳结束和染色脱色完成后,工作人员必须将电泳片由机器中取出,对实验室较为麻烦。但是因为这类仪器所能做项目比较多,且灵敏度较高仍为许多实验室所接受。农业仪器权威门户 http:/ 11 号 联系电话：0571-81953317 http:/ 全自动电泳分析系统:集上述仪器的优点 ,自动点样、电泳、呈色(或染色、脱色) 、烘干。可用各种电泳片,包括琼脂片、醋酸片、聚丙烯酰胺等,采用可见光及荧光呈色双系统,是一种较理想的电泳仪。 5. 双向电泳及双向电泳 2
5、 液相色谱 2 质谱联用: 双向电泳第一向为等电聚焦 ,第二向为梯度十二烷基磺酸钠( SDS)电泳。样品经过电荷与质量两次分离后可得到分子的等电点、分子量等信息,这是目前所有电泳技术中分辨率最高,信息量最多的技术,已成为分析复杂蛋白混合物的基本工具。自 1975 年 ,OFarrel等建立这种技术后, 已有许多改进,使得这一技术日趋完善。ISO2DALT 系统的第一向是用管状凝胶 ,虽然分辨率高、上样量大、耐高盐等优点,但有阴极漂移而丢失碱性蛋白、载体两性电解质 pH 梯度不稳定、受电场和时间影响而重复性不好等缺点。20 世纪 80 年代后期 , Gorg 等将固相 pH 梯度等电聚焦技术用作
6、双向电泳的第一向,称为 IPG2DALT。固相 pH 梯度等电聚焦没有阴极漂移, pH 梯度稳定, 分辨率高,重复性好,是目前流行的双向电泳技术。与传统的单向电泳方法最多只能分析 100 种蛋白质样品相比,双向电泳最多可分析 5 000 10 000 个蛋白点的图谱。双向电泳在分离蛋白混合样品,比较差异方面有不可替代的作用。当发现新的蛋白点时 ,将其切下再用液相色谱分离,与质谱联用,最后可鉴定新发现的蛋白质组分。 6. 高效毛细管电泳及高效毛细管电泳 2 质谱联用:高效毛细管电泳是以弹性石英毛细管为分离通道,以高压直流电场为推动力,依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离
7、分析方法。利用毛细管代替平板凝胶,分离效率得以提高。高效毛细管电泳的应用范围从小分子、无机离子到生物大分子,甚至整个细胞 ,从带电粒子到中性分子都可用高效毛细管电泳方法进行分析。目前,毛细管与质谱的接口难题已经解决 ,人们能利用毛细管电泳的高效分离能力与质谱的鉴定技术联用发挥其特殊功能,发现未知的化合物。尤其是阵列毛细管电泳仪已经问世,这将克服目前大多数商品化毛细管电泳仪只能进行单根毛细管电泳的缺陷,这种高通量的新方法将会给后基因组时代的基因分析带来革命性的变化。7. 毛细管电泳芯片:利用毛细管电泳芯片可以进行 DNA 长度、序列和基因分型等分析 ,在临床检测,尤其在遗传病的诊断中具有重要意义
8、。现在分离 DNA,是利用芯片分离荧光标记的寡核苷酸,整个分离过程在 45 s 之内,而芯片的长度仅为 318 cm。因为其可承载高电压(2 300 V / cm)并具有较小的样品体积,故有利于得到较好的分离效果。而用传统的毛细管电泳分离技术分离 DNA 样品,通常需要 1030 min,电压也只能加到 500 V / cm。另外有人制作的用于高速 DNA 分离的芯片,有效长度仅为 315 cm,分离从 701 000bp 的 DNA 片断,时间在 120 s 以内。目前 ,高速、高通量的毛细管电泳芯片已经发展得比较完善。2002 年笔农业仪器权威门户 http:/ 11 号 联系电话：057
9、1-81953317 http:/ Caliper 公司设计的 DNA 电泳芯片,即在一个光盘大小的芯片上有 96 个毛细管电泳阵列,分别与 96 个样品池相连,呈辐射状,并采用一个旋转的共聚焦荧光检测系统对信号进行检测。此系统可以同时对 96 个不同的样品进行分离,分离检测过程在 8 min 以内。 8. DNA 测序系统: 该系统利用凝胶毛细管的原理,将多道毛细管阵列设计,用 4 种不同的荧光染色标记 4 种核苷酸 ,在模板上合成 DNA 单链,然后在 DNA 外切酶的作用下进行碱基的连续水解和释放,用激光识别和记录释放的碱基。可用于 DNA 序列测定,杂合子自动检测, 点突变分析,等位基
10、因鉴定, SNP 筛查 ,杂合性缺失检测,AFLP 指纹图谱 ,微卫星 DNA 的不稳定性分析,基因表达,测序质量评估,序列比较等。20 世纪 90 年代中期, 测序仪重大改进,集束化的毛细管电泳代替凝胶电泳。2001 年完成人类基因组框架图提前完成得益于多通道、集束化的毛细管凝胶电泳技术的出现。目前,在我国已有少数医院开始采用 8 通道的 DNA 测序,系统开展用拉米夫定治疗乙型肝炎病毒(HBV) 的 YMDD 突变检测。 二、电泳技术临床应用 随着新的电泳技术的出现,各种自动化电泳分析仪问世并相继被引入临床实验室 ,电泳技术在临床疾病的诊断中正发挥越来越多的作用,特别是为各种体液蛋白质、同
11、工酶等的检测提供了新的手段。 1. 血清蛋白电泳:新鲜血清经醋酸纤维薄膜或琼脂糖电泳、染色后, 常见白蛋白、1、2、和 球蛋白 5 条带。血清蛋白质电冰图谱是了解患者血清蛋白质全貌的有价值的方法,可用为初筛试验。急性炎症或急性时相反应时常以 1、2 区带加深为特征;妊娠型 1 区带增高,伴有 区带增高 ;肾病综合征、慢性肾小球肾炎时呈现白蛋白下降,1、 球蛋白升高;缺铁性贫血时可由于转铁蛋白的升高而呈现 区带增高,而慢性肝病或肝硬化呈现白蛋白显著降低, 球蛋白升高 23 倍 ,示免疫球蛋白( Ig)多克隆高 ,甚至可见 桥,还可在 区呈现细而密的寡克隆区带;单克隆 Ig 异常症(M 蛋白血症)
12、则在电冰区带 区呈现致密而深染,高度集中的蛋白克隆增生区带(M 蛋白区带) 。 2. 尿蛋白电泳:尿蛋白电泳的主要目的是在无损伤的情况下, 协助临床判断肾脏病变的严重程度。当不能进行肾活检时,尿蛋白电泳结果能很好地协助临床判断肾脏的主要损害。尿蛋白电泳后呈现出中、高分子蛋白区带主要反映肾小球病变,呈现出低分子蛋白区带可见于肾小管病变或溢出性蛋白尿(如本周蛋白 ) ;混合性蛋白尿可见到各种分子量区带 ,示肾小球和肾小管均受累及。对临床症状不典型的患者及微量蛋白尿患者的诊断及各种肾脏疾病治疗过程中病情的动态分析也具有很大价值。 3. 脑脊液蛋白电泳:若在脑脊液 (CSF)标本中检出寡克隆区带,而其
13、相应血标本中未能检出区农业仪器权威门户 http:/ 11 号 联系电话：0571-81953317 http:/ Ig,具有重要临床意义。但为保证正确的比较与分析,须将患者血清和 CSF 在同一天同步进行分析,以论证不同来源的 Ig。中枢合成 Ig 是中枢神经系统疾患的一个重要信号,主要用于多发性硬化症、痴呆、脊髓炎、亚急性脑白质炎、神经性梅毒等中枢神经系统疾患的诊断和鉴别诊断。 4. 血红蛋白及糖化血红蛋白电泳:应用电泳法鉴别患者血液中 Hb 的类型及含量对于贫血类型的临床诊断及治疗具有重大意义。HbA2 增高是 2轻型地中海贫血的一个重要特征, HbA2 减低见于缺铁性贫血及其他 Hb
14、合成障碍性疾病(常见如 2地中海贫血) 。电泳发现异常 Hb 如 HbC、HbD、HbE 、 HbK 和 HbS 等则可诊断为相应的 Hb 分子病。在酸性条件下电泳,可将糖化血红蛋白的不同组分 HbA1 a, HbA1 b 和 HbA1 c 分离开来, HbA1 c 形成与 RBC 内葡萄糖有关, 可特异性反映测定前 6 8 周体内葡萄糖水平。此外,糖化血红蛋白可对某些患者因 HbF 增高所造成 HbA1 c 假性升高作出解释。 5. 免疫固定电泳:可对各类 Ig 及其轻链进行分型,最常用于临床常规 M 蛋白的分型与鉴定。一般用于单克隆 Ig 增殖病、单克隆 Ig 病、本周蛋白和游离轻链病、多
15、组分单克隆 Ig 病、重链病、CSF 寡克隆蛋白鉴别、多克隆 Ig 病的诊断和鉴别诊断。 6. 同工酶电泳:临床上用于同工酶或同工酶亚型分析。 (1)乳酸脱氢酶(LD /LDH)同工酶:用琼脂糖凝胶电泳(AGE)法可分离出 5 种同工酶区带(LD1 LD5 ) 。主要用于急性心肌梗死(LD1 LD2 )及骨骼肌疾病(LD5 升高) 的诊断和鉴别诊断。恶性肿瘤、肝硬化时可见 LD5 明显升高,或在胸腹水中出现一条异常 LD6 区带。(2)肌酸激酶(CK) 同工酶:采用 AGE 法可分离出 3 种 CK 同工酶。当出现异常同工酶如巨肌酸激酶 1 (CK1 ) 、巨 CK2 等时,从电泳图谱上很容易发现。CK2MB 在心肌梗死早期增加和短时间内达峰值也是心肌再灌注的指征。CK2BB 增高见于脑胶质细胞瘤、小细胞肺癌和胃肠道恶性肿瘤,后者还常有 CK2Mt 增高。 (3)CK 同工酶亚型:指 CK2MM 亚型(CK2MM1、CK2MM2 、CK2MM3 )和 CK2MB 亚型(CK2MB1、CK2MB2 ) ,常采用琼脂糖凝胶 IEF 或高压电泳。采用琼脂糖凝胶高
