《春草莓表面霉菌鉴定及其致腐能力研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《春草莓表面霉菌鉴定及其致腐能力研究（8页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、春草莓表面霉菌鉴定及其致腐能力研究 魏超 代晓航 郭灵安 雷欣宇 四川省农业科学院分析测试中心 农业部农产品质量安全风险评估实验室(成都) 摘 要： 目的 调查春草莓表面霉菌的总体状况, 对主要致腐真菌进行致腐能力和产毒素研究, 为草莓的保鲜及食用安全评价提供理论依据。方法 对 60 份春草莓样品进行霉菌检测, 分离霉菌采用 ITS 序列测序方法进行鉴定;利用高效液相色谱法及酶联免疫法对腐烂草莓及真菌发酵液中赭曲霉毒素 A (ochratoxin A, OTA) 和展青霉素 (patulin, PAT) 进行检测, 对出现率较高的霉菌进行草莓复接试验, 判断其致腐能力。结果 健康草莓表面的霉菌
2、计数对数值 3.55.5 的占样品总数的 83%;毛霉菌属、枝孢菌属和青霉菌属在草莓中出现率较高;由这 3 类霉菌致草莓腐烂样品和其发酵液均检测不出真菌毒素 OTA 和 PAT, 复接试验中毛霉属真菌在 36 h 在草莓表面形成明显菌斑, 72 h 可形成明显菌斑而更大面积软腐。结论 草莓表面存在大量且多种霉菌, 霉菌侵染草莓是导致其腐烂主要诱因, 毛霉属霉菌占主要生态位但青霉菌属、枝孢菌属霉菌更易导致其软腐, 草莓表面霉菌不会产生真菌毒素而对草莓进行二次污染。关键词： 草莓; 霉菌; ITS 序列; 赭曲霉毒素 A; 作者简介：代晓航, 硕士, 副研究员, 研究方向为微生物检测及相关风险评估
3、。E-mail:作者简介：魏超, 硕士研究生, 助理研究员, 研究方向为微生物检测及相关风险评估。E-mail:基金：国家农产品质量安全风险评估重大专项 (GJFP201601302) Identification and capability of causing-spoilage of moulds on strawberryWEI Chao DAI Xiao-Hang GUO Ling-An LEI Xin-Yu Analysis and Testing Center of Sichuan Academy of Agricultural Sciences; Abstract： Objec
4、tive To investigate the general condition of the molds on the surface of spring strawberry and their capabilities of causing-spoilage and producing toxins, so as to provide the theoretical basis for the preservation and safety evaluation of strawberry. Methods The moulds of 60 spring strawberry samp
5、les were tested and the isolated moulds were identified by ITS sequencing. The ochratoxin A (OTA) and patulin (PAT) in spoilage strawberries and mould fermentation broth were detected by high performance liquid chromatography (HCLP) and enzyme-linked immune sorbent assay (ELISA) . Multi-joint tests
6、of strawberry were conducted to moulds with high incidence to assess their capabilities of causing-spoilage. Results For the fresh strawberry, the samples on which there were moulds with the logarithm values of 3.55.5 accounted for 83% of the total samples. The occurrence rates of Mucor sp., Mycobac
7、terium sp. and Penicillium sp. in strawberry were relatively high and OTA and PAT could not be detected in the fermentation broth and spoilage strawberry samples caused by the three moulds. In the multiplex tests, the Mucor sp. formed obvious plaque on the surface of strawberry after 36 h and caused
8、 strawberry soft and putridity after 72 h. Conclusion There are various moulds with large numbers on the surface of strawberry and their infection to strawberry is the main cause for its spoilage. Mucor sp. account for the main ecological niche but Penicillium sp. and Cladosporium sp. are more likel
9、y to lead to the softness and rot of strawberry, however, the moulds on the surface of strawberry will not bring a secondary pollution by producing mycotoxins.Keyword： strawberry; mould; internal transcribed spacer; ochratoxin A; 1 引言草莓为多年生草本, 种植喜温凉气候, 花托增大变为肉质, 瘦果春季成熟, 集生花托上, 合成红色浆果状体1。草莓皮薄多汁, 加之成果
10、期适宜的气候条件导致其极易被霉菌感染。对草莓等果蔬食用安全评价研究多集中在农药残留等方面, 有研究表明草莓表面的微生物及其次生代谢产物也可成为其食用安全的隐患2,3。致腐霉菌是导致果蔬表腐败的主要原因, 霉菌感染不仅会影响其外观品质, 也会导致水果中的果胶蛋白质等营养成分流失而造成严重的经济耗损4,5, 部分真菌引起水果腐烂同时释放真菌毒素对水果造成二次污染, 人食用后会诱发疾病6-8, 美国、欧盟等相关机构也对果蔬表面真菌及毒素暴露评估进行检测, 使其成为果蔬食用风险评估的主要对象6,9。对含糖量较高的水果常见的致病真菌主要有镰刀菌 (Fusarium) 、木霉 (Trichoderma)
11、葡萄孢菌 (Botrytinia) 、青霉菌属 (Penicillium) 、链格孢菌属 (Alternaria) 等10, 其常见的真菌毒素有 4 大类, 包括单端孢霉烯族毒素、展青霉素、赭曲霉毒素和交链孢霉毒素。其中展青霉素 (patulin, PAT) 是一种覆盖范围的水果污染物, 在多种水果、水果制品中均有发现8,11-13。展青霉素具有较强的毒性作用, 具有生育毒性、遗传毒性和细胞毒性、致癌毒性等14,15。赭曲霉毒素, 属于聚酮类化合, 它是由曲霉属曲霉和青霉属青霉菌产生真菌毒素, 其中赭曲霉毒素 A (ochratoxin A, OTA) 毒性最强, 在自然界分布最广泛, 对人类
12、和动植物影响最大6,16。本实验在调查 60 份不同基地春草莓样品霉菌的总体情况, 分离得到 10 个菌属霉菌 101 株采用 ITS 测序的方法对其进行鉴定, 对出现率较高的霉菌进行复接试验, 通过液相色谱法对和酶联免疫法对其腐烂草莓和出现率较高的霉菌发酵液的 OTA 和 PAT 进行测定, 为草莓食用安全及风险评估提供科学依据。2 材料与方法2.1 实验材料春草莓样品 60 份, 采自成都龙泉、双流、大邑、天府新区 60 个草莓基地, 采集时间为 2017 年 34 月, 每份样品随机抽样 3 kg。2.2 仪器与试剂YM-75-Z 高压灭菌锅 (上海三申公司) ;MJX-500 培养箱
13、(上海齐欣公司) ;PTC0200 PCR 仪 (美国 BIQ-RAD) ;液相色谱仪 (美国 Agilent 公司) ;Varioskan 酶标仪 (英国 Thermo 公司) 。孟加拉红、PD 培养基 (广东环凯公司) ;乙腈、甲醇 (色谱纯, 美国 Fisher Scientific 公司) ;OTA 标准品 (美国 SUPELCO 公司) ;引物正向引物 (1TS1) :5-TCCGTAGGTG AACCTGCGG-3, 反向引 (ITS4) :5-TCCTCCGCTTATTG ATATGC-3 (成都擎科公司) ;由成都擎科公司测序。OTA 免疫亲和柱 (北京中检维康) ;0.22m
14、 滤膜 (津腾公司) ;DNA 提取试剂盒 (天根公司) ;展青霉素酶联免疫试剂盒 (美国 REAGEN) 。2.3 实验方法2.3.1 霉菌的分离与鉴定分离方法参考 GB 4789.15-2016食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数, 在孟加拉红培养基上纯化单菌 2 次, 30培养 7290 h, DNA 提取根据试剂盒使用说明书对真菌 DNA 进行提取, 提取后的 DNA 进行 ITS 序列 PCR扩增, 体系为 25L:底物 DNA 1L、引物 ITS1 和 ITS4 各 1L、Master Mix 12.5L、dd H 2O 9.5L。反应条件:953 min;9430 s、
15、5530 s、7230 s, 共进行 35 个循环;72延伸 9 min。扩增产物进行双向测序, 测序结果提交 NCBI 比对, 获得鉴定相关结果。采用 Dnaman 软件对序列进行整理, MAGA 6.0 软件的最大简约法算法 (maximum parsimony) 构建发育树。2.3.2 霉菌的复接试验选取出现率较高的 3 种霉菌, 液体发酵培养, 发酵培养为 PD 培养基 30震荡培养 120 h。取 1 m L 发酵液于无菌生理盐水 1:100 (V:V) 震荡稀释喷洒在健康草莓表面, 均质袋封口, 28培养 26 d, 观察草莓腐烂情况, 将腐烂草莓采用 2.3.1 的方法进行霉菌分
16、离培养鉴定。2.3.3 真菌毒素的检测试验设计对 3 种复接试验后腐烂草莓及 3 种真菌发酵液进行真菌毒素检测, 健康草莓做空白对照, 试验方法如下:(1) OTA 的检测称取 20 g 样品于三角瓶内, 加入 4 g Na Cl 和 100 m L70%甲醇, 震荡 1.5 h, 滤纸过滤, 移取取过滤液 5 m L 于 15m L dd H2O, 涡旋混匀后离心 10 min (4000 r/min) , 过 OTA 免疫亲和柱, 弃滤液, 采用 20 m L dd H2O 清洗柱子, 吹干柱子后用 1 m L 甲醇洗脱, 经 dd H2O 1:1 稀释后过滤膜上机。仪器条件:C18 色谱柱光检测器激发光波长 (Ex) 为 330nm, 发射波长 (E m) 为477 nm;流动相 H2O:乙腈:甲酸=50:49:1 (V:V:V) ;流速 1.0 m L/min;运行时间7 min;柱温 40;进
