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1、监测细胞内氧化还原代谢状态的遗传编码荧光探针 赵玉政 张卓 杨弋 华东理工大学光遗传学与合成生物学交叉学科研究中心合成生物学与生物技术实验室 华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室 华东理工大学药学院上海市新药设计重点实验室 摘 要： 原位、高时空分辨地检测细胞内氧化还原代谢状态是生命科学研究的一个瓶颈问题和迫切需求.然而, 依赖细胞裂解、酶学、色谱、质谱等传统生化分析方法难以实时监测细胞内氧化还原代谢变化, 更难以应用于高通量药物筛选.基于荧光蛋白的探针成像是近年来生命科学和医学领域迅速发展的一种分析检测技术.由于这些荧光探针实现了在活细胞内实时、动态地监测生物学过程, 从而革命性地改变了
2、生命科学研究.相对于化学小分子荧光探针, 遗传编码的荧光蛋白探针在精确定位亚细胞结构、消除人为干扰以及活体应用方面, 存在显著的优势.近年来, 科学家针对细胞内重要的氧化还原代谢物, 发明了多种多样的遗传编码荧光探针, 实现了在单细胞、亚细胞甚至活体内对氧化还原代谢状态的特异性检测和成像, 大大推动了相关研究领域的发展.本文将以细胞内两对关键的氧化还原代谢分子 NADH/NAD+和 NADPH/NADP+为例, 重点介绍相关荧光探针的设计、性质、应用以及使用注意事项, 以方便研究者更好地了解和使用相关技术.关键词： 氧化还原代谢; NADH/NAD+; NADPH/NADP+; 成像; 荧光蛋
3、白; 遗传编码的荧光探针; 作者简介：赵玉政, E-mail:;作者简介：杨弋, 收稿日期：2017-03-20基金：国家重点基础研究发展计划 (批准号:2013CB531200) Monitoring intracellular redox metabolism with genetically encoded fluorescent sensorsZHAO YuZheng ZHANG Zhuo YANG Yi Synthetic Biology and Biotechnology Laboratory, Optogenetics & Molecular Imaging Interdisci
4、plinary Research Center, East China University of Science and Technology; Abstract： In-situ life measurement of intracellular However, redox metabolism methods with high spatiotemporal resolution remains to be mass an obstacle in not science research.lysis, traditional including in enzymatic assays,
5、 chromatography and spectrometry require suitable with cell therefore suffer from some defects real-time detection of redox metabolism powerful in living for cells and are for high-throughput screen.Recently fluorescent encoded imaging has become a tool biomedical research the development to of vari
6、ous monitor genetically biological fluorescent in sensors as well as chemical probes.These approaches life allow us dynamically Comparing processes living cells, and have made sensors revolutionary possess changes in science including research.precise with chemical probes, genetically encoded fluore
7、scent many advantages, subcellular localization, genetically minor encoded artificial disturbance and high been suitability for in vivo study.redox In the past decade, enabling different imaging research give types redox field of fluorescent sub-cellular review, sensors have developed as to and moni
8、tor metabolites, states at single-cell biology.or this resolution as well in vivo achieving exciting progresses in the NADH/NAD+ and NADPH/NADP+ biosensors for example, we will application of redox In the taking a detailed description on design, apply property, these and practical concerns of geneti
9、cally encoded fluorescent sensors to better understand and tools.Keyword： redox metabolism; NADH/NAD+; NADPH/NADP+; imaging; fluorescent protein; genetically encoded fluorescent sensors; Received： 2017-03-20国家重点基础研究发展计划 (批准号:2 0 1 3 C B 5 3 1 2 0 0) 、国家自然科学基金 (批准号:9 1 3 1 3 3 0 1, 3 1 2 2 5 0 0 8, 3
10、 1 4 7 0 8 3 3, 9 1 6 4 9 1 2 3, 3 1 6 7 1 4 8 4) 、上海市科委项目 (批准号:1 4 X D 1 4 0 1 4 0 0, 1 6 4 3 0 7 2 3 1 0 0, 1 5 Y F 1 4 0 2 6 0 0) 、1 1 1 计划 (批准号:B 0 7 0 2 3) 、中国科协“青年人才托举工程”、上海市青年拔尖人才、高等学校博士学科点专项科研基金、生物反应器工程国家重点实验室和中央高校基本科研业务费资助氧化还原反应存在于所有生物体内, 这些反应不仅参与了生物体内众多的生命活动, 如生物大分子分解代谢和合成代谢、线粒体功能、钙稳态、氧化还原
11、稳态、基因表达、离子通道、细胞周期、免疫反应、细胞增殖、分化、衰老和死亡等, 也与癌症、糖尿病、肥胖症、心血管疾病、神经退行性疾病、冠心病、老年痴呆、慢性损伤和炎症等多种疾病的发生和发展有密切关系.根据氧化还原代谢物的性质, 可主要分为以下三类:(1) 辅酶类, 主要包括烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (n i c o t i n a m i d e a d e n i n e d i n u c l e o t i d e, N A D H/N A D) 和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (n i c o t i n a m i d e a d e n i n e d i nu c l e o t i d
12、e p h o s p h a t e, N A D P H/N A D P) .N A D H/N A D 作为生物体内辅酶和核心代谢物, 介导了糖酵解、三羧酸循环以及线粒体呼吸等能量代谢途径中的多数氧化还原反应13.因此, N A D H/N A D 常被用作评价细胞内能量代谢状态的一个关键指标14.N A D P H 作为生物体内辅酶, 主要由磷酸戊糖途径产生.此外, 苹果酸酶 M E 1/3、异柠檬酸脱氢酶 I D H 1/2、亚甲基四氢叶酸脱氢酶 M T H F D 1/2 以及烟酰胺核苷酸转氢酶 N N T 催化的氧化还原反应也可产生 N A D P H2,5,15.N A D P
13、 H 为细胞内谷胱甘肽 (g l u t a t h i o n e, G S H/G S S G) 和硫氧还蛋白 (T r x/T r x-S S) 两大氧化还原体系以及生物大分子合成提供还原力2,16.因此, N A D P H/N A D P 常被用作评价细胞内氧化还原代谢状态的一个重要指标2,5.长久以来, N A D H/N A D 和 N A D P H/N A D P 的检测主要依赖细胞裂解的酶循环法、色谱法、电化学法、毛细管电泳法以及代谢物间接指示法.然而, 这些方法不仅破坏了细胞或生物体的完整性, 也易在抽提过程中引入人为干扰.为了在活细胞或活体水平评价细胞代谢活动, 研究者
14、主要利用微弱的 N A D (P) H 自发荧光 (激发:3 4 0n m;发射:4 5 0n m) 12,17.由于该信号绝大部分来自线粒体, 因此常被用来评价线粒体的功能12.细胞浆中 N A D (P) H 荧光信号通常只有线粒体的 1/51/418,19, 且常混入线粒体信号部分, 使得更加参考文献1 Titov D V, Cracan V, Goodman R P, et al.Complementation of mitochondrial electron transport chain by manipulation of the NAD+/NADHratio.Science,
15、 2016, 352:231-235 2 Fan J, Ye J, Kamphorst J J, et al.Quantitative flux analysis reveals folate-dependent NADPH production.Nature, 2014, 510:298-302 3 CantC, Menzies K J, Auwerx J.NAD+metabolism and the control of energy homeostasis:a balancing act between mitochondria and the nucleus.Cell Metab, 2
16、015, 22:31-53 4 Zhang H, Ryu D, Wu Y, et al.NAD+repletion improves mitochondrial and stem cell function and enhances life span in mice.Science, 2016, 352:1436-1443 5 Lewis C A, Parker S J, Fiske B P, et al.Tracing compartmentalized NADPH metabolism in the cytosol and mitochondria of mammalian cells.Mol Cell, 2014, 55:253-263 6 Ying W.NAD+/NADH and NADP+/NADPH in cellular functions and cell death:regula
