《气体clo2对猕猴桃青霉的抑菌作用及其机理》由会员分享，可在线阅读，更多相关《气体clo2对猕猴桃青霉的抑菌作用及其机理（11页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、气体 ClO2 对猕猴桃青霉的抑菌作用及其机理 王烨 薛敏 郭晓强 冯翠娇 高贵田 陕西师范大学食品工程与营养科学学院 摘 要： 以生长处于对数期的猕猴桃青霉为实验对象, 研究气体 ClO2对猕猴桃青霉的抑制作用及主要细胞内容物渗漏的影响。结果表明:气体 ClO2对青霉孢子的萌发与菌丝体的生长有较好的抑制作用, 0.8mg/L 处理 7min 及 0.6mg/L 处理 10min均可完全抑制猕猴桃青霉孢子的萌发;2.8mg/L 处理 25min 可以完全抑制青霉菌丝体的生长。气体 ClO2损害了青霉细胞屏障功能及细胞膜的渗透性, 气体 ClO2对猕猴桃青霉蛋白质、DNA、K +的渗漏量影响较大
2、, 与青霉的抑制率相关性较强, 可能是抑制青霉的重要原因;而气体 ClO2对猕猴桃青霉 Mg2+、Ca 2+的渗透量影响较小。关键词： 青霉; 气体 ClO2; 猕猴桃; 抑菌机理; 识别分类; 作者简介：高贵田, 男, 副教授。E-mail:收稿日期：2016-11-14基金：陕西省科技统筹创新工程计划项目 (2014KTCL02-19) Bacteriostasis and antimicrobial mechanism of chlorine dioxide gas on penicillium sp. of Kiwi fruitWANG Ye XUE Min GUO Xiaoqiang
3、 FENG Cuijiao GAO Guitian School of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University; Abstract： Taking Penicillium sp.of Kiwi Fruit as experimental subjects, the bacteriostasis of chlorine dioxide gas on both Penicilliumsp.and the leakage of main cellular content of kiwi fruit are
4、 studied.The results shows that chlorine dioxide gas could both inhibit the germination of Penicilliumsp.spores and the growth of mycelium.The germination of Penicilliumsp.spores were completely inhibited when the kiwi fruit was treated with chlorine dioxide gas about 0.8 mg/L for 7 minutes and abou
5、t 0.6 mg/L for 10 minutes.And a 25-minute treatment of chlorine dioxide gas under the concentration of 2.8 mg/L might exterminate the growth of mycelium.Chlorine dioxide gas damaged the barrier function and the membrane permeability of Penicillium sp.cells.No matter how long the time of treatment of
6、 Penicilliumsp.toward kiwi fruit would be, there is always a strong correlation between the leakage of protein, DNA and the inhibition rate of Penicilliumsp., which may be the important reason of inhibiting Penicilliumsp.Meanwhile, there are minor effects of chlorine dioxide gas on the leakage of ma
7、gnesium ions and calcium ions.Keyword： Penicillium sp.; chlorine dioxide gas; kiwi fruit; antibacterial mechanism; Received： 2016-11-14猕猴桃是陕西省重要的园艺经济作物之一, 其产量、种植面积均为全国之首。猕猴桃种植逐渐产业化, 而其在贮藏过程中的问题也不断涌现, 这在一定程度上制约了猕猴桃产业的发展速度1。在猕猴桃贮藏期间, 主要引起猕猴桃发病的优势病原菌为青霉属 (Penicilliumsp.) , 段爱莉等2利用 rDNA-ITS 方法从“华优”“海沃德”
8、“秦美”猕猴桃品种中分离出青霉菌株 19 种, 占总菌株的 63.3%。因此, 抑制青霉菌的生长、防治猕猴桃青霉病的发生是猕猴桃贮藏过程中的重要工作之一。ClO 2作为联合国世界卫生组织 (WHO) 确认的 A1 级杀菌消毒剂, 以其良好的扩散性、穿透性3和易降解、无残留4的特点, 在众多领域得到了广泛应用5-7。但 ClO2对微生物的抑制机理一直未研究透彻, 已报道的研究多数是以病毒、细菌为研究对象, 而真菌的细胞结构比细菌、病毒复杂, ClO 2对真菌的抑菌机理与细菌及病毒的抑菌机理可能存在差异, 故本实验以猕猴桃青霉作为研究对象, 探索气体 ClO2对真核微生物的抑制作用及抑制机理, 为
9、高效应用气体 ClO2提供理论参考。1 材料与方法1.1 实验材料与仪器实验青霉 (Penicillium sp.) , 从猕猴桃病果中分离、纯化, 陕西师范大学食品生物技术实验室保藏。ClO 2缓释剂, 天津市张大科技发展有限公司;其他试剂为分析纯试剂, 购自国药集团化学试剂有限公司。PDA 培养基:20% (质量分数) 土豆汁、2%葡萄糖、1.5%2%琼脂粉, 1 000mL 蒸馏水, pH 自然。不加琼脂粉为 PD 培养基。麦克奥迪 BA200 生物显微镜, 杭州量子检测仪器有限公司;新苗超净工作台, 上海新苗医疗器械制造有限公司;SPX 智能型生化培养箱、HWS 智能型恒温恒湿培养箱,
10、 宁波江南仪器厂;722 可见分光光度计, 上海光谱仪器有限公司;紫外吸收分光光度计, 北京普析通用;ICS-1500 离子色谱仪, 美国戴安。1.2 实验方法1.2.1 气体 ClO2的产生与测定参照文献8方法, 采用缓释剂加水的方法获得气体 ClO2, 用丙二醛法测定其浓度。1.2.2 猕猴桃青霉孢子悬液制备参照文献9方法进行。1.2.3 猕猴桃青霉菌生长曲线的测定充分摇匀上述猕猴桃青霉孢子悬液, 用无菌移液枪吸取 1mL 分散于装有 30mL PD 培养基的三角瓶中。接种后放入 28、转速为 180r/min 振荡培养箱中培养, 每隔 4h 取出一瓶进行称重:抽滤前称量滤纸重量, 再采用
11、真空泵将瓶内所有培养物抽滤于滤纸上, 将抽滤物放在温度为 100105烘箱里烘干至恒重, 用电子天平称量烘干后抽滤物的质量, 此重量减去滤纸重量即为青霉菌体生长一定时间的生物量。以猕猴桃青霉液体培养的时间做横坐标, 纵坐标为每个时间青霉菌丝体重量, 绘制青霉的生长曲线。1.2.4 气体 ClO2对猕猴桃青霉的抑菌作用(1) 气体 ClO2对猕猴桃青霉孢子萌发的抑制效果。将 200L 稀释后的青霉孢子悬液涂布于 PDA 平板上并放入无菌密封箱中, 打开培养皿盖, 分别用浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/L 的气体 ClO2常温下密封处理 7min, 每个处理设置 3 个
12、平行, 不经气体 ClO2处理即为对照, 采用 PDA 表面萌发法将处理后的平板与对照置于 28生化培养箱中培养 48h 后计数。采用浓度为 0.6mg/L 气体 ClO2在常温密封条件下, 对青霉孢子悬液处理1、3、5、7、9、15、30、60min, 随后采用 PDA 表面萌发法将平板置于 28生化培养箱中培养 48h 后进行菌落计数, 每组处理设置 3 个平行, 以不处理的平板作为对照。(2) 气体 ClO2对猕猴桃青霉菌丝体的抑制效果。在 28、180r/min 条件下将猕猴桃青霉菌培养至对数增长期, 用接种环挑取大小一致的菌丝体于 PDA 培养基上, 在常温下, 用浓度为 0.4、0
13、.8、1.2、1.6、2、2.4、2.8mg/L 气体 ClO2处理 10min, 研究气体 ClO2处理浓度对青霉菌丝的抑菌作用。每组实验设置 3个平行, 以不处理的平板作为对照, 将处理后的平板与对照置于 28生化培养箱中培养 67d, 采取十字交叉法量取菌落直径, 计算气体 ClO2对青霉菌丝体生长的抑菌率。猕猴桃青霉菌丝体培养同上。在常温下采用 2.8mg/L 气体 ClO2对青霉菌丝体处理 1、5、10、15、20、25、30、60min, 研究气体 ClO2处理时间对青霉菌丝的抑菌作用。以不处理的平板作为对照, 每组处理设置 3 个平行, 随后将平板置于 28生化培养箱中培养 67
14、d, 量取菌落直径, 计算气体 ClO2对青霉菌丝体生长的抑菌率。1.2.5 气体 ClO2对猕猴桃青霉细胞内容物渗透的影响猕猴桃青霉菌丝体培养同上。用接种环挑取大小均一的单个青霉菌丝体, 接于载玻片上, 每个载玻片上接 15 个菌丝体。在常温下采用 2.8 mg/L 气体 ClO2对青霉菌丝体处理, 处理时间为 0、1、5、10、15、20、25、30、60 min, 每组3 个平行, 将处理后的菌丝体与载玻片置于离心管中, 吸取 30mL0.9%无菌生理盐水充分振荡, 在 4 000r/min 的转速下离心 10min, 收集上清液备用。在常温下于无菌密封箱内用气体 ClO2对菌丝体处理
15、10min, 处理浓度为0、0.4、0.8、1.2、1.6、2、2.4、2.8mg/L, 每组 3 个平行, 将处理后的菌丝体与载玻片置于离心管中, 吸取 30mL 0.9%无菌生理盐水充分振荡, 在 4 000r/min 的转速下离心 10min, 收集上清液备用。采用可见分光光度计法测定上清液中青霉细胞蛋白质的渗漏, 采用紫外吸收分光光度计法测定青霉细胞DNA 的渗漏, 采用离子色谱法测定上清液中青霉细胞钾离子 (K) 、钙离子 (Ca) 、镁离子 (Mg) 的渗漏。2 结果与分析2.1 猕猴桃青霉的生长曲线将数量相同的猕猴桃青霉接于分装有 PD 培养液的三角瓶内, 置于 28、180r/
16、min 的震荡器中培养, 每 4h 取出一瓶, 抽滤烘干后, 称量菌丝重量, 结果如图 1 所示。图 1 猕猴桃青霉生长曲线 Fig.1 Growth curve of Penicilliumsp. 下载原图由图 1 得, 猕猴桃青霉在 PD 培养液中随着时间的延长不断生长, 生长 24h 后, 猕猴桃青霉菌的菌丝重量迅速增加, 青霉生长进入对数期, 在培养 60h 后, 青霉的菌丝重量增长速度变缓, 生长量趋于平稳, 达到对数期末期。青霉在生长60h 时, 生命活力最大, 故本实验将培养 60h 的青霉作为试材进行下一步研究。2.2 气体 ClO2对猕猴桃青霉的抑制效果2.2.1 气体 ClO2对猕猴桃青霉孢子萌发的抑制效果不同气体 ClO2浓度、处理时间对猕猴桃青霉孢子萌发的抑制率如图 2、3 所示。图 2 不同浓度气体 ClO2 对猕猴桃青霉孢子萌发抑制效果的影响 Fig.2 Inhibition effect of Peni
