《血栓通胶囊对氧糖剥夺复氧致huvec细胞紧密连接损伤的改善作用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《血栓通胶囊对氧糖剥夺复氧致huvec细胞紧密连接损伤的改善作用（8页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、血栓通胶囊对氧糖剥夺/复氧致 HUVEC细胞紧密连接损伤的改善作用 杨爱玲 武汀 张天睿 韩冰 孙建宁 张硕峰 北京中医药大学 哈尔滨珍宝制药有限公司 摘 要： 目的 采用氧糖剥夺 (OGD) 致 HUVEC 细胞损伤模型, 考察三七总皂苷 (PNS) 及其单体 Rg1、Rb1 对氧糖剥夺致血管内皮紧密连接损伤的保护作用。方法 HUVEC细胞接种于 Transwell 细胞小室, 待细胞融合后, 设立实验组别:正常组、模型组、PNS 10、20、40 mg/L 组以及 Rb1 13.52 mg/L、Rg1 12.44 mg/L 组, 于缺氧同时进行药物干预, 氧糖剥夺 6 h 复氧 24 h
2、后, 检测 HUVEC 内皮细胞电阻值以及内皮渗透性的变化;采用激光共聚焦显微镜, 免疫荧光法检测 HUVEC 细胞ZO-1、claudin-5 蛋白表达的变化。结果 与正常对照组相比, HUVEC 细胞缺氧6 h 复氧 24 h 后内皮细胞间紧密连接电阻显著降低, 细胞渗透性显著升高 (P0.05) 。PNS 20、40 mg/L 组能够显著抑制模型组紧密连接电阻的降低, 抑制 HUVEC 细胞渗透性的升高 (P0.05) 。人参皂苷 Rb1 能够显著升高 OGD 6 h复氧 24 h 后内皮紧密连接电阻, 降低 HUVEC 细胞渗透性 (P0.05) 。免疫荧光检测结果显示, 正常组 HU
3、VEC 细胞的 ZO-1 及 claudin-5 蛋白主要分布于细胞膜周围, 排列连续, 显示出内皮细胞的典型铺路石排列。缺氧 6 h 复氧 24 h 损伤后, 模型组细胞边缘的紧密连接蛋白显著减少, 环形结构断裂, 甚至消失, 细胞核内紧密连接蛋白呈增加趋势。PNS 20、40 mg/L 及 Rb113.52 mg/L 可观察到细胞间紧密连接局部恢复, 呈铺路石样结构。结论 PNS 对缺血致血管内皮细胞间紧密连接损伤有保护作用。关键词： 血栓通胶囊; PNS; HUVEC 细胞; 紧密连接; 作者简介：杨爱玲 (1991-) , 女, 硕士研究生, 专业:心脑血管疾病研究。E-mail:作者
4、简介：张硕峰 (1969-) , 男, 副教授, 硕士生导师, 研究方向:中药防治心脑血管疾病研究。E-mail:基金：国家自然基金 (81503287) Xueshuantong capsule alleviates oxygen-glucose deprivation/reoxygenation-induced tight junction damage of HUVEC cellsYANG Ailing WU Ting Zhang Tianrui HAN Bing SUN Jianning ZHANG Shuofeng Beijing University of Chinese Medi
5、cine; Harbin Zhenbao Pharmaceutical Co.Ltd.; Abstract： Objective To study the protective effect of Panax notoginseng saponins (PNS) and its components Rg1 and Rb1 on oxygen-glucose deprivation/reoxygenation (OGD/Reox) -induced tight junction damage. Methods Anaerobic box were used to induce OGD in H
6、UVEC cells for 6 h followed by reoxygenation for 24 h. Transepithelial/endothelial electrical resistance (TEER) and cell permeability were detected, immunefluorescence was used to observe the ZO-1 and claudin-5 protein expression. Results PNS 20, 40 mg/L and ginsenoside Rb1 significantly inhibited t
7、he OGD/Reox-induced decreased tight junction resistance, and the increased cell permeability (P 0.05) . PNS 20, 40 mg/L and ginsenoside Rb1 partly restored the inter-cellular tight junctions which were regularly arranged on the cell membrane, and the cells displayed cobble stone-like arrangement. Co
8、nclusions PNS ameliorates ischemia-induced vascular endothelial cell tight junction damage via MMP-9 and VEGF/VEGFR2 signaling pathway. Rb1 is one of the effective monomer components.Keyword： xueshuantong; XST; Panax notoginseng saponins; PNS; human umbilical vein endothelial cells; HUVEC cells; tig
9、ht junction; oxygen-glucose deprivation/reoxygenation (OGD/Reox) ; 血栓通胶囊 (xueshuantong, XST) 1是开发的一种血栓通注射液改良口服制剂, 其主要成分为三七总皂苷 (Panax notoginseng saponins, PNS) , 主要作用是活血祛瘀, 通脉活络。临床上常用于中风偏瘫、胸痹心痛。此课题前期结果显示, PNS 对脑缺血再灌注模型小鼠脑微血管白蛋白渗出有抑制作用。但是, PNS 对缺血致血管紧密连接损伤的保护作用及其内在调控机制未见报道, 亟待深入研究。因此, 本实验借助 Transwell
10、 小室, 构建 HUVEC 细胞紧密连接模型, 考察 PNS 对氧糖剥夺/复氧 (oxygen-glucose deprivation and re-oxygenation, OGD/R) 致细胞紧密连接损伤的改善, 从体外角度考察 PNS 对缺血致内皮紧密连接损伤的保护作用, 探讨 PNS 有效单体成分, 为 PNS 口服制剂的临床应用提供理论依据。1 材料和方法1.1 药品与试剂血栓通胶囊原料三七总皂苷, 哈尔滨珍宝制药有限公司提供, 为类白色至淡黄色无定形粉末, 味苦, 微甘, 批号 20111201, 主要单体成分为 Rg1 (31.1%) 、Rb1 (33.8%) 、Rd (7%)
11、、Re (3.9%) 、R1 (9.2%) , 试验前用 PBS 配制。ECM 培养基 (1001) , 批号 19130, Sciencell 公司;无糖培养基, Gibco 公司;fluorescein isothiocyanate-dextran 70 k D (FD70S) , 批号 SLBG0356V, Sigma 公司;Transwell 细胞小室, BD 公司;Prolong Gold antifade reagent with DAPI (P36941) , 批号 1753492, Thermofisher 公司;封闭用正常羊血清ZLI-9022, 批号 WK153325, 中
12、杉金桥生物技术有限公司;厌氧产气条, 批号1003976390, Bio Merieux 公司;厌氧指示条 (96118) , 批号 1004170150, Bio Merieux 公司;甲醇, 批号 20021022, 北京化工试剂厂。1.2 主要仪器MERS00002 电阻仪, 由 Millipore 公司生产;厌氧盒, 由 Bio Merieux 公司生产;圆形细胞爬片 (24 孔) , 型号 WHB-24-CS, WHB 生产;压力蒸汽灭菌器, 超净工作台, 由上海博讯实业有限公司医疗设备厂生产;电热恒温鼓风干燥箱, 由黄石市恒丰医疗器械有限公司生产;细胞培养箱, 由美国 Revco
13、公司生产;倒置显微镜, 由德国 Leica 公司生产;台式低温离心机, 由北京众益中和生物技术有限公司生产。1.3 实验方法1.3.1 内皮间紧密连接电阻将 HUVEC 细胞按照 1.010/cm 接种于 Transwell 24 孔板, 上室 300L 培养液, 下室 700L 培养基, 采用 EVOM2 电阻仪检测跨内皮电阻 (transendothelial electrical resistance, TEER) 值, 通过减去空白对照没有接种细胞小室膜的TEER 值, 得到该小孔细胞的 TEER 值。自 TEER 值即将稳定作为起始开始记录。待 Transwell 中内皮细胞培养 4
14、 d 达到完全融合, 将细胞培养基换成无糖培养基置缺氧箱中缺氧 6 h 后, 换成正常 ECM 内皮培养基置 37, 5%CO 2培养箱中再灌注 24 h, 检测 TEER 值。给药组设定 PNS 终浓度为 10、20、40g/m L;人参皂苷 Rb1 13.52g/m L;人参皂苷 Rg1 12.44g/m L。1.3.2 内皮细胞间渗透性将 HUVEC 按照 1.010/cm 接种于 24 孔板, 上室 300L 培养液, 下室 700L培养基, 待 Transwell 中内皮细胞培养 4 d 达到完全融合, 开始实验。在 Transwell 上室中加入终浓度为 1 mg/m L FITC
15、-葡聚糖 (70 kd) 的无糖培养基 200L, 下室加入无糖培养基 700L, 置缺氧盒中缺氧 6 h 后, 以正常ECM 完全培养基替换无糖培养基, 置正常培养箱复氧 24 h 后, 在每个下池取样品 100L, 置于 96 孔板中, 用多功能酶标仪测定荧光强度, 激发波长为 490 nm, 发射波长为 520 nm, 检测渗透到下室 FITC-葡聚糖的荧光强度。给药组设定 PNS 终浓度为 10、20、40g/m L;人参皂苷 Rb1 13.52g/m L;人参皂苷Rg1 12.44g/m L。依据 FITC-葡聚糖的荧光强度判断葡聚糖渗透到外池的量, 从而判断 PNS 对紧密连接蛋白
16、的调控。1.3.3 免疫荧光取出已固定好的内皮细胞爬片, 置常温甲醇中, 移至-40固定 30 min, 取出置室温 10 min, PBS 漂洗 10 min3 次;加入封闭液, 37封闭 30 min;加入兔抗大鼠 ZO-1 (1:100) 、claudin-5 (1:100) 37孵育 1 h, PBS 漂洗 10 min3 次;加入二抗 FITC 标记羊抗兔以及 FITC 标记羊抗小鼠, 避光, 37孵育 30 min;PBS 漂洗 5 min3 次;加入含 DAPI 封闭液, 避光, 室温孵育 5 min, PBS 漂洗 5 min2 次, 30%甘油封片, 指甲油固定, 置荧光显微镜下观察并拍照。2 结果2.1 三七总皂苷及人参皂苷 Rb1、Rg1 改善氧糖剥夺致 HUVEC 细胞电阻值损伤PNS 20、40 mg/L 组能够显著抑制模型组紧密连接电阻的降低 (模型组, 655.0;PNS
