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1、载槲皮素-粉防己碱纳米凝胶的制备、表征与体外评价 陈昳冰 崔元璐 天津中医药大学中医药研究院 摘 要： 目的制备一种纳米凝胶制剂以提高槲皮素及粉防己碱的生物利用度及抗氧化性。方法通过反相乳化法制备载槲皮素-粉防己碱纳米凝胶 (QU-TE-NP) ;通过粒径与 Zeta 电位测定, 透射电子显微镜 (TEM) , 差示扫描量热分析 (DSC) 以及傅里叶变换红外光谱 (FT-IR) 进行表征分析;高效液相法测定两种药物的载药率及包封率;1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼 (DPPH) 清除实验比较槲皮素及该纳米凝胶的体外抗氧化性。结果该纳米凝胶通过钙离子交联, 平均粒径为 (38.861.81)
2、nm, Zeta 电位为 (-15.94.1) m V, 槲皮素和粉防己碱的载药率分别为 (0.980.04) %和 (2.750.07) %, 包封率分别为 (96.801.10) %和(94.800.90) %。纳米凝胶的抗氧化性明显优于槲皮素单体。结论纳米凝胶体系的制备可提高槲皮素及粉防己碱的水溶性, 并增强其抗氧化能力。关键词： 槲皮素; 粉防己碱; 纳米凝胶; 抗氧化; 超声雾化; 作者简介：陈昳冰 (1992-) , 女, 硕士, 研究方向为分子药剂学。作者简介：崔元璐, E-mail:。收稿日期：2017-07-20基金：国家自然科学基金面上项目 (81473542) Prepa
3、ration and characterization of quercetin-tetrandrine nanoparticle and evaluation in vitro and in vivoCHEN Yi-bing CUI Yuan-lu Research Center of Traditional Chinese Medicine, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine; Abstract： Objective To prepare a nanoparticle to improve the bioavailabil
4、ity and antioxidant activity of quercetin and tetrandrine.Methods The quercetin-tetrandrine-nanoparticle (QU-TE-NP) was prepared by reverse microemulsion method. The QU-TE-NP was characterized by particle size and zeta potential analysis, transmission electron microscope (TEM) , differential scannin
5、g calorimetry (DSC) and Fourier-transform infrared spectroscopy (FT-IR) . The drug loading and encapsulation efficiency were measured by high performance liquid chromatography (HPLC) . The antioxidant activities of quercetin and QU-TE-NP were compared by DPPH radical scavenging experiment. Results T
6、he nanoparticles formed a stable new phase by cross-linking. The average particle size was (38.86 1.81) nm and the Zeta potential was (-15.94.1) m V. The drug loading and entrapment efficiency of quercetin and tetrandrine were (0.98 0.04) %, (2.750.07) %, (96.801.10) %, (94.800.90) %, respectively.
7、The antioxidant activity of QU-TE-NP was superior to quercetin. ConclusionThe QU-TE-NP formulation enhanced the water-solubility of quercetin and tetrandrine, resulting in improved antioxidant capacity.Keyword： quercetin; tetrandrine; nanoparticle; anti-oxidant; ultrasonic atomization; Received： 201
8、7-07-20纳米药物制剂近年来在基础研究和临床应用中表现出巨大的潜力。纳米凝胶指直径小于 200 nm 的凝胶, 与微米尺度的微粒相比, 纳米凝胶具有更大的比表面积, 而载药的纳米凝胶会具有更强的生物活性或药理活性1。海藻酸钠是一种天然多糖, 具有药物制剂辅料所需的稳定性、溶解性和安全性, 英国化学家E.C.Stanford 首次发现其具有形成凝胶和成膜的能力, 现广泛应用于制药辅料、组织工程及生物材料等领域2。近年来, 有大量的文献报道过槲皮素及粉防己碱广泛的生理活性3-5, 如槲皮素的抗氧化性、抗肿瘤、抗炎以及抗血小板聚集等活性6-9;粉防己碱的抗心律失常、抗心肌缺血、抗肿瘤多药耐药性等
9、活性, 特别是对肺癌及肺纤维化有明显的治疗作用10-11。但是, 这两种药物的水溶性差, 在很大程度上, 限制了其临床应用。因此, 本研究将槲皮素和粉防己碱制备成纳米凝胶, 既可提高药物的水溶解度, 还可以增强其药效, 能更好地发挥其药物的治疗作用。1 材料和方法1.1 主要材料槲皮素 (生工生物工程股份有限公司, 纯度 99%, 中国) ;粉防己碱 (江苏永健医药科技有限公司, 纯度 99%, 中国) ;槲皮素标准品, 粉防己碱标准品 (中国食品药品检定研究院) ;无水氯化钙 (纯度95%, 天津市风船化学试剂科技有限公司, 中国) ;液体石蜡 (分析纯, 天津市风船化学试剂科技有限公司,
10、中国) ;甲醇 (色谱纯, 天津康科德有限公司, 中国) ;海藻酸钠, 吐温-80, 司盘-80, 罗丹明 B (Sigma-Aldrich 公司, 美国) ;1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼 (DPPH, Alfa aesar 公司, 美国) ;EURO-STPCV S25 顶置式电子搅拌器 (IKA 公司, 德国) ;RCT basic 加热型磁力搅拌器 (IKA 公司, 德国) ;Allegra-64R 型高速离心机 (Beckman Coulter 公司, 美国) ;1260 型高效液相色谱仪 (Agilent 科技公司, 美国) ;Zetasizer Nano-Zs 型激光粒径测定仪
11、 (Malvern 公司, 英国) ;TENSOR 27 型傅立叶转换红外光谱仪 (Beckman Coulter 公司, 德国) ;Jade差示扫描量热仪 (Perkin Elemer 公司, 美国) ;Infinite M200 型多功能读板机 (TECAN 公司, 瑞士) 。1.2 纳米凝胶的制备1.2.1 海藻酸钠溶液的配制精确称量海藻酸钠 250 mg 溶于 50 m L 纯水中, 设置温度 45, 置于磁力搅拌器上, 600 r/min 搅拌 6 h, 得到浓度为 0.5% (W/V) 的海藻酸钠水溶液。1.2.2 固化剂的配制精确称量无水氯化钙 15 mg, 槲皮素 22.5 m
12、g, 粉防己碱 112.5 mg 溶于 15 m L 95%乙醇中, 涡旋混匀, 得到固化剂。空白纳米凝胶 (B-NP) 的固化剂中未加入槲皮素和粉防己碱。1.2.3 空白纳米凝胶及载槲皮素-粉防己碱纳米凝胶 (QU-TE-NP) 的制备在圆底烧瓶中先加入 150 m L 液体石蜡, 然后分别加入 1.05 m L 和 0.45 m L的司盘-80、吐温-80, 使 HLB 值为 7.5。设置温度 40, 500 r/min 搅拌 30 min 后, 缓慢滴入 45 m L 海藻酸钠水溶液, 控制流速为 0.75 m L/min, 调整转速 1 000 r/min, 滴加完毕后继续搅拌 1 h
13、。通入氮气, 缓慢滴加固化剂 15 m L, 控制流速为 0.15 m L/min, 转速 1 000 r/min, 滴加完毕后继续搅拌 1 h。1 h 后停止搅拌, 将液体转移至 50 m L 离心管中, 3 800 r/min 离心 10 min, 使水相和油相分层, 弃去油相, 收集下层水相, -80预冻后置于冷冻干燥机中冻干 24 h, 所得样品即为空白 B-NP 或 QU-TE-NP。1.3 QU-TE-NP 包封率与载药率的测定1.3.1 色谱条件色谱柱:Kromasil 100-5 C 18色谱柱 4.6 mm250 mm, 5m;流动相:甲醇:0.2%磷酸水溶液为 8515;检
14、测波长:280 nm, 360 nm;流速:1.0 m L/min;进样量:10L;柱温:30。1.3.2 对照品溶液的制备精密称取于 105干燥至恒重的槲皮素及粉防己碱对照品各 2.0 mg。加甲醇超声溶解, 定容至 10 m L 的容量瓶中。用甲醇稀释至不同浓度, 按照上述色谱条件测定。1.3.3 样品溶液的制备载药率样品溶液的制备:精密称取 QU-TE-NP 样品 25 mg, 放置于 50 m L 离心管中, 分 3 次加入甲醇 (10、7、5 m L) , 每次超声助溶 30 min 后转移至 25 m L 棕色容量瓶中, 加甲醇定容。按照色谱条件下方法测得浓度为 C1。包封率样品溶
15、液的制备:取同一批次的纳米凝胶 10 mg, 加入 1 m L 去离子水, 完全溶解后, 吸取 200L 至 0.5 m L 超滤离心管 (分子截留量:50 000) 中, 3 500 r/min 离心 30 min, 吸取套管中离心所得清液, 另取一份未经离心的槲皮素纳米凝胶 200L, 去离子水稀释至 400L。按照色谱条件下方法测得浓度分别为 C2、C3。1.3.4 线性关系考察将槲皮素和粉防己碱对照品梯度稀释, 得到一系列浓度的对照品溶液, 0.45m孔径微孔滤膜过滤, 进样测定, 记录峰面积。以峰面积 (Y) 为纵坐标, 对照品溶液浓度 (X) 为横坐标, 绘制标准曲线。槲皮素及粉防
16、己碱的线性回归方程分别为:Y 赞=400 696X-3.983 7, r=0.999 9;Y 赞=6 221.4X-0.046 2, r=0.999 8。结果表明, 槲皮素在 0.001 3-0.042 mg/m L 的浓度范围, 粉防己碱在0.006 40.10 mg/m L 的浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。1.3.5 包封率与载药率的测定按照上述方法, 分别对载药率样品溶液及包封率样品溶液进行槲皮素和粉防己碱的含量测定, 按照以下公式计算:载药率=W 槲皮素 /W 纳米凝胶包封率= (W 槲皮素 -W 游离槲皮素 ) /W 槲皮素其中, W 槲皮素 表示测定得到的槲皮素总量, W 纳米凝胶 表示所称量的纳米凝胶总量, W 游离槲皮素 表示测定得到的未包封游离的槲皮素量。1.4 QU-TE-NP 的表征分析1.4.1 QU-TE-NP 的粒径及电位测定取 QU-TE-NP 溶液 1 m L, 去离
