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1、基于质谱技术的糖链结构解析研究进展 赵克力 黄纯翠 武红梅 李岩 中国科学院生物物理研究所 中国科学院大学 广东中科康仪生物技术有限公司 摘 要： 糖组学是继基因组学、蛋白质组学之后, 又一门新兴的学科, 其主要是研究糖分子的结构与功能.糖是一类比核酸、蛋白质更加独特的生物分子, 它们不仅是生物体储存能量和释放能量的主要物质, 更是生物体内的信息传递分子, 并且在生理和病理过程中扮演着重要的角色, 如细胞间的识别作用、炎症以及自身免疫疾病等.在结构上, 糖类物质更为复杂, 具有宏观不均一性 (蛋白质上有多个糖基化位点) 和微观不均一性 (同一结合位点上可以连接不同的多糖) , 所以糖链的结构解
2、析一直是糖组学研究的难题.相较于传统的分析方法, 质谱法具有高灵敏度、高精度、高通量等优势, 被认为是在糖链结构解析过程中重要的分析方法.本文综述了质谱、多级质谱、液相色谱-质谱、毛细管电泳-质谱等方法在糖组学中糖链结构解析的研究进展.关键词： 糖组学; 聚糖; 质谱; 多级质谱; 结构分析; 作者简介：李岩, 1998 年获得北京大学医学部药学学士学位, 2004 年获得美国马里兰大学分析化学博士学位, 2005 至 2011 年在美国约翰霍普金斯大学医学院病理系进行博士后培训, 并留任助理研究员, 2011 年 7 月作为“中国科学院引进杰出技术人才”引进, 现任中国科学院生物物理研究所研
3、究员, 博士生导师, 从事临床检验新方法新技术的开发应用.主要从事生物质谱与临床质谱技术的研究与转化.研究方向主要包括以下三个方向:发展适用于生物样品的高通量糖组学分析技术方法, 满足临床检验与生物制药等科研需要;发展临床质谱检验技术用于疾病精准检测与辅助治疗, 进行产品化研发;承担中国科学院中国人群前瞻性生物样本库建设任务, 进行中国人群基线数据采集等健康相关研究.Tel: 010-64887212, E-mail: 收稿日期：2017-01-04基金：国家重点基础研究发展计划 (973) (2013CB910100) Progress in Understanding of Glycan
4、Structure Analysis Based on Mass SpectrometryZHAO Ke-Li HUANG Chun-Cui WU Hong-Mei LI Yan Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences; Abstract： Glycomics represents a novel omics technology developed after the genomics and proteomics, which focus on the glycan structure and function.As a g
5、roup of biomolecule, glycans provide and store energy within the cell, and play many significant roles in physiological and pathological processes, such as cell-cell recognition and inflammatory and autoimmune diseases.Structural analysis of glycan is the bottleneck of glycomics research, due to the
6、ir macro-heterogeneity (site occupancy) and micro-heterogeneity (different glycoforms attached to one glycosylation site) . Comparing with traditional analysis approaches, mass spectrometry has become the method of choice for structural analysis methods in glycan, thanks to its ability to require mi
7、nute amounts of sample, gain more different information and to be used in combination with high-throughput analysis methods. This paper summarizes the advance in our understanding of glycan structures using mass spectrometry (MS) , including multistage mass spectrometry (MSn) , LC-MS and CE-MS.Keywo
8、rd： glycomics; glycan; mass spectrometry; multistage mass spectrometry; structure analysis; Received： 2017-01-04过去人们一直认为糖是生物体内的储存能量和释放能量的主要物质, 但是随着研究的不断深入, 研究人员发现糖类分子是继核酸和蛋白质之后的第三类生物信息分子, 广泛地参与了生理病理活动, 如信息传递、细胞生长发育、免疫细胞调节、肿瘤发生发展等过程.糖类分子可以根据其组成单元数量分为单糖、寡糖、多糖.在生命体中, 糖类物质通常以糖复合物的形式出现, 即糖蛋白、蛋白聚糖、糖肽、糖脂等,
9、 从而实现其生物学功能1-4.糖组学 (glycomics) 与基因组学、蛋白质组学有着密切的关系, 被认为是基因组学和蛋白质组学的延续, 其主要研究目标是在大规模水平上研究糖类物质, 包括了对糖类物质的富集与分离, 糖链结构的鉴定和糖分子在生命系统中功能的研究.根据基因组和蛋白质组的定义, 将一个细胞或某个组织表达的全部糖链或是某一类特定的糖链称为糖组 (glycome) 5-7.与核酸和蛋白质相比, 糖类分子的一级结构更为复杂, 不仅需要确定糖链的序列信息和单糖种类, 还需要确定其手性、连接方式和异头物构型等立体结构.以相同数目单体组成的寡糖链通过不同的连接位点、不同的拓扑结构以及不同的空
10、间构型 (、) 等形成的异构体数目就远远大于前两者.此外, 由于大多数糖类化合物是呈中性或酸性, 很容易形成聚合物 (n=1103) 以及多种修饰结构, 如乙酰化、磷酸化、硫酸化等, 而且单糖的种类数目繁多8-10.所以, 糖链结构鉴定与解析是糖组学研究中最具有挑战性的难题之一.与蛋白质组学和代谢组学一样, 传统的分析技术如核磁共振、色谱、凝集素芯片等也应用到了糖类物质的分析, 由于糖类物质结构复杂, 具有宏观和微观不均一性, 所以在糖链结构研究过程中遇到了瓶颈11.而基于质谱的糖链解析技术, 由于其可以直接对糖链进行定性分析, 提供糖链的结构信息, 并且具有高灵敏度、高通量、高精度等优势,
11、特别是软电离技术的发展, 使得生物质谱成为糖组学研究的主要工具12.近年来, 糖链结构解析和糖类物质生物学功能等方面的研究取得了不少进展.伴随着以质谱分析技术为平台, 糖链的释放与制备技术的不断提升, 以及各种分析方法的相继建立, 使得糖结构信息逐渐被解析出来.本文主要对生物质谱技术在糖结构分析中的应用及进展进行分析与总结.1 糖链的制备与获取绝大多数的糖类分子是以糖复合物的形式出现, 如糖蛋白、糖脂、糖肽、蛋白质聚糖等.在哺乳动物中, 糖类分子主要以糖蛋白的形式出现, 根据糖类分子与氨基酸连接方式的不同大致上可以分为 3 类:N-糖、O-糖以及葡萄胺聚糖 (GAGs) .因此, 对每种糖链进
12、行分析之前, 需要将其从蛋白质、脂质上释放出来.在糖链的定性分析中, 每种糖链的释放都有其独特或者首选的方法, 释放糖链的质量高低和效率都会影响后续实验的效果.所以, 从糖复合物中获取糖链是对其功能研究和结构解析至关重要的一步.目前, 糖链的释放主要有酶解法和化学方法两大类5,13-14.N-糖链一般是指糖链的还原性末端以 N-糖肽键方式连接到肽链的天冬酰胺 (Asn) 上, 其核心结构是 Man3Glc NAc2.一般情况下, 对于 N-糖链的获取采用酶解法, 通常使用肽-N-糖苷酶 F (PNGase F) , 特异性切断 N-乙酰葡糖胺与天冬酰胺形成的糖肽键, 得到带有还原性末端的完整
13、N-糖链.除了 PNGase F 外, 还有 PNGase A 和内切糖苷酶 ENDO F1、F2、F3、ENDO H 等, 这些酶也经常配合使用.此外, 非特异性的蛋白水解酶如链霉蛋白酶等也可以用来释放 N-糖链, 通过控制使用量和酶切时间, 可以将糖蛋白水解为低分子质量的糖肽甚至是只含有一个氨基酸的糖链, 从而解决长链蛋白对糖基化位点掩盖15.2017 年, Chen 等16利用人工改造后的 Fbs1 可以识别并结合 N-糖基化糖肽中 N-糖链的核心结构 (M 3N2) 的特性, 从而实现了对 N-糖的高度富集.与凝集素相比, 此方法大大地增加了 N-糖链信息的覆盖性和完整性.O-糖链是指
14、糖链中某一糖基的羟基通过糖肽键与肽链的丝氨酸 (Ser) 或苏氨酸 (Thr) 相连.与 N-糖相比, 其结构上更为复杂, 存在多种连接形式和多种核心结构, 例如通过 N-乙酰葡糖胺与丝氨酸、苏氨酸形成的糖肽键, 除此之外半乳糖、甘露糖、木糖也可以与丝氨酸、苏氨酸共价结合形成 O-糖肽键, 所以没有特征修饰序列作为其位点的预测.另外, 尚未发现可以将 O-糖链整体从蛋白质或多肽上水解的内切酶.因此, 对于 O-糖链的释放一般采用化学法, 即在碱性条件下通过 消除反应完成, O-糖链的还原末端被还原成糖醇17.最近, Wu等18-19基于实验之前发明使用超滤膜富集细胞和血清中 N-糖链的方法,
15、此次又使用 10 ku 超滤膜辅助 O-糖链的富集, 利用分子质量的差异, 将 消除后的 O-糖进行分离富集, 再使用 MALDI-MS 对甲基化后的 O-糖链进行分析.这种方法实现了快速和高通量地解析 O-糖链, 并将此方法应用到了临床样本的分析中, 鉴定了血清、尿液中的 O-糖.糖脂是糖分子与脂质分子通过共价作用形成的糖复合物.根据脂质物质的不同, 又可以分为以糖链的还原末端与神经酰胺连接形成的鞘糖脂 (glycosphingolipid-glycans, GSL) , 以及与丙三醇或二酰基甘油连接形成的甘油糖脂 (glycoglycerolipids) 20-21.对于糖脂分子上糖链的释
16、放一般会使用酶解法和化学法两种.Anugraham 等21建立了将中性和酸性糖脂固定到PVDF 膜上, 再使用神经酰胺糖内切酶释放糖链的方法.并利用这种方法分析了子宫内膜癌血浆、组织、细胞系 (10) 中的鞘糖脂糖链结构.有时候, 为了提高质谱检测的灵敏度, 常常需要对糖分子进行衍生化, 主要包括甲基化法、乙酰化法和还原氨化法.Desantos-Garcia 等22就是对由胎球蛋白等糖蛋白上获取的 N-糖进行了固相全甲基化的尝试, 这种方法不仅提高了衍生化效率、降低氢氧化钠的使用量、增强了信号强度, 而且此方法已经在人血清的糖组分析中得到应用.目前, 阻碍糖链的获取主要有两方面因素:一方面是多糖不能像核酸、蛋白质拥有可以编码的模板, 从而进行扩增;另外, 对不同连接方式的糖链难以分离, 影响了糖链的获取, 造成了糖链信息的丢失, 进而阻碍了糖链结构的解析工作.Song 等23提出了一种氧化法获取糖链的策略, 通过使用次氯酸钠 (Na Cl O)
