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1、繁茂膜海绵来源青霉属真菌Penicillium sp.HPQJ10 的化学成分研究 杨君泽 何山 丁立建 宁波大学浙江省海洋生物技术重点实验室 宁波大学李达三叶耀珍伉俪李本俊海洋生物医药研究中心 摘 要： 目的 研究繁茂膜海绵 Hymeniacidon perleve 来源青霉属真菌 Penicillium sp.HPQJ10 的次级代谢产物。方法 利用正相硅胶柱色谱、葡聚糖凝胶 Sephadex LH-20 以及半制备高效液相等色谱分离手段进行分离纯化, 根据波谱学数据鉴定化合物结构。结果 从发酵产物中共分离到 14 个单体化合物, 分别鉴定为 N- (Z) -2- (4-hydroxyph
2、enyl) ethenylformamide (1) 、2, 4-dimethoxyphenyl acetate (2) 、6, 8, 5, 6-四羟基-3-甲基黄酮 (3) 、4-羟基苯乙酸 (4) 、cyclo- (L-Pro-L-Val) (5) 、cyclo- (L-Pro-L-Leu) (6) 、邻苯二甲酸二异丁酯 (7) 、邻苯二甲酸二丁酯 (8) 、7-hydroxy-2- (2-hydroxypropyl) -5-methyl chromone (9) 、2- (2, 4-dimethoxylphenyl) -3- (4-hydroxybenzyl) -1, 2, 4-tria
3、zole (10) 、 (22E, 24R) -麦角甾-5, 7, 22-三烯-3-醇 (11) 、cyclo- (Leu-Pro-Ile-Pro) (12) 、2, 4-二甲氧基苯甲酸 (13) 、3-甲氧基苯酚 (14) 。结论 除化合物 1、3、10、11 以外, 其他化合物均为首次从该菌种中分离得到。关键词： 繁茂膜海绵; 青霉属真菌; 邻苯二甲酸二异丁酯; 2, 4-二甲氧基苯甲酸; 3-甲氧基苯酚; 作者简介：杨君泽 (1992) , 男, 河南信阳人, 在读硕士研究生, 主要研究方向为海洋天然药物。E-mail:作者简介：丁立建 (1987) , 男, 浙江台州人, 博士, 讲师
4、, 主要研究方向为海洋微生物药物。E-mail:收稿日期：2017-07-22基金：国家自然科学基金资助项目 (41776168, 41706167) Study on chemical constituents from sponge-derived fungus Penicillium sp.HPQJ10YANG Jun-ze HE Shan DING Li-jian Key Laboratory of Marine Biotechnology of ZheJiang Province, Ningbo University; Abstract： Objective To study the
5、 secondary metabolites of sponge-derived fungus Penicillium sp. HPQJ10. Methods The compounds were isolated and purified by chromatographic methods on silica gel, Sephadex-LH20 columns and semi-prep HPLC. The structures were established on the basis of spectroscopic data interpretation. Results Fort
6、een compounds were isolated and identified as N- (Z) -2- (4-hydroxyphenyl) ethenyl formamide (1) , 2, 4-dimethoxyphenyl acetate (2) , 6, 8, 56-tetrahydroxy-3-methylflavone (3) , 4-hydroxyphenylacetic acid (4) , cyclo- (L-Pro-L-Val) (5) , cyclo- (L-Pro-L-Leu) (6) , diisobutyl phthalate (7) , dibutyl
7、phthalate (8) , 7-hydroxy-2- (2-hydroxy Propyl) -5-methyl chromone (9) , 2- (2, 4-dimethoxylphenyl) -3- (4-hydroxybenzyl) -1, 2, 4-triazole (10) , (22 E, 24 R) -ergenol-5, 7, 22-trien-3-ol (11) , cyclo- (Leu-Pro-Ile-Pro) (12) , 2, 4-dimethoxybenzoic acid (13) , and 3-methoxyphenol (14) . Conclusion
8、Except for compounds 1, 3, 10, and 11, other compounds are isolated from Penicillium sp. for the first time.Keyword： Hymeniacidon perleve; sponge-derived fungus; diisobutyl phthalate; 2, 4-dimethoxybenzoic acid; 3-methoxyphenol; Received： 2017-07-22近年来, 随着陆生微生物资源的不断研究和开发, 从中发现全新结构或作用机制独特的天然产物的概率也越来越
9、小。由于海洋生态环境具有缺氧、高盐、高压、寡营养、低光照等特点, 使海洋微生物具有独特的生长途径和代谢机制, 从而能产生更多结构新颖、活性独特的天然产物1-2。因此, 从海洋微生物资源中发掘药物先导化合物已成为新药研发的一个重要发展趋势。作为微生物的重要组成部分, 海洋真菌已成为新的海洋生物活性物质的重要来源, 并受到天然产物研究工作者的广泛关注3, 据不完全统计, 2010 年 1 月至 2013 年 2 月期间已经有 895 个海洋微生物来源的新化合物被报道, 其中 576 个来源于海洋真菌, 占 64.36%。这足以说明海洋来源真菌确实是产生新化合物的巨大宝库4。海洋真菌来源的新化合物主
10、要集中在海藻、海绵和红树林等 3 大海洋生物栖息地, 它们占海洋真菌来源次级代谢产物的 56%, 其中海绵来源的就占近 20%5, 因此海绵来源真菌成为天然产物的重要来源。为了发掘海绵来源真菌的活性物质, 本课题组对东海海绵来源的真菌进行筛选, 发现该菌株次级代谢产物非常丰富。因此, 本实验对该菌株的次级代谢产物进行深入研究, 通过多种色谱分离方法从中分离得到 14 个化合物, 分别鉴定为 N- (Z) -2- (4-hydroxyphenyl) ethenylformamide (1) 、2, 4-dimethoxyphenyl acetate (2) 、6, 8, 5, 6-四羟基-3-甲
11、基黄酮 (6, 8, 5, 6-tetrahydroxy-3-methylflavone, 3) 、4-羟基苯乙酸 (4-hydroxyphenylacetic acid, 4) 、cyclo- (L-Pro-L-Val) (5) 、cyclo- (L-Pro-L-Leu) (6) 、邻苯二甲酸二异丁酯 (diisobutyl phthalate, 7) 、邻苯二甲酸二丁酯 (dibutyl phthalate, 8) 、7-hydroxy-2- (2-hydroxypropyl) -5-methylchromone (9) 、2- (2, 4-dimethoxylphenyl) -3- (4
12、-hydroxybenzyl) -1, 2, 4-triazole (10) 、 (22E, 24R) -麦角甾-5, 7, 22-三烯-3-醇 (22E, 24R) -ergenol-5, 7, 22-trien-3-ol, 11、cyclo- (Leu-Pro-IlePro) (12) 、2, 4-二甲氧基苯甲酸 (2, 4-dimethoxybenzoic acid, 13) 、3-甲氧基苯酚 (3-methoxyphenol, 14) 。化合物 2、49、1214为首次从该菌种中分离得到。1 仪器与材料Bruker Avance 400 MHz 核磁共振仪 (德国 Bruker 公司)
13、 ;超净工作台 (Air Tech 苏净安泰空气技术有限公司) ;超低温冰箱 (海尔集团) ;高压蒸汽灭菌锅 (三洋电机株式会社) ;电热鼓风干燥箱 (上海一恒科技有限公司) ;恒温培养箱 (宁波江南仪器厂) ;Biometra PCR 仪 (德国耶拿分析仪器有限公司) ;JUNYI 600 君意电泳仪 (北京君意东方电泳设备有限公司) ;Gentrifuge 5415R Eppendorf 离心机、Eppendorf 恒温培养摇床 (德国艾本德股份有限公司) ;凝胶成像分析系统 (Bioshine Gel1850, 上海欧翔科学仪器有限公司) ;旋转蒸发仪 (郑州长城科工贸有限公司) ;高校
14、液相色谱仪 (美国 Waters 公司) , 正相硅胶 200300 目 (青岛海洋化工厂) ;Sephadex LH-20;色谱级甲醇 (CNW, 上海安谱实验科技股份有限公司) ;工业醋酸乙酯;其他试剂均为分析纯。2 方法2.1 菌株来源及纯化菌株分离自浙江舟山东极岛海域采集的繁茂膜海绵 Hymeniacidon perleve。取海绵组织 1 g, 加入 9 m L 无菌水, 使用涡旋振荡器震荡 5 min 后得到悬浊液。使用常规的稀释涂布法涂布于 12 种分离培养基 (培养基中都添加了质量浓度为100 mg/m L 的氨苄青霉素和链霉素) , 见表 16, 28恒温培养。挑取形态差异较
15、大的单菌落, 划线培养, 纯化为单一菌落后 4冰箱平板保存。通过菌落大小、颜色等外在特点, 进行初步排重, 最终得到 72 株真菌。这些菌株在-20和-80下进行甘油管保藏。表 1 真菌分离培养基成分 Table 1 Composition of medium used for fungal isolation 下载原表 2.2 菌株鉴定与化学筛选对分离到的 72 株菌株采用马丁氏培养基进行小量发酵筛选, 于 28恒温摇瓶培养 14 d, 对它们的代谢产物进行 HPLC 分析, 其中有 15 株菌株的次级代谢产物十分丰富, 可供进一步研究。本研究对这 15 株菌株采用 PCR 扩增技术通过 I
16、TS 引物对菌株 DNA 进行扩增, 将获得的基因片段送交测序, 最后得到的测序结果在 NCBI 中进行 Blast 比对, 确定菌株的种属关系。根据同源性比对, 菌株 HPQJ10 与 Penicillium sp.相似度为 99%, 故鉴定其为青霉属真菌 Penicillium sp.。由于菌株 HPQJ10 的次级代谢产物丰富多样, 因此选择 Penicillium sp.HPQJ10 作为本研究的目标菌株进行探究, 其粗提物的 HPLC 及系统发育树见图 2、3。2.3 菌株发酵将-80低温条件下保藏的菌株 Penicillium sp.HPQJ10 取出, 经平板活化 3 次后备用。配置马丁氏液体培养基, 将菌种接种到液体培养基中, 采用 1 L 锥形瓶培养, 每瓶装液体培养基 400 m L, 恒温摇床 28培养, 待长出菌丝球, 留做种子液备用。将种子液以 5
