《大肠杆菌dh5a感受态的制备,质粒验证》由会员分享，可在线阅读，更多相关《大肠杆菌dh5a感受态的制备,质粒验证（4页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、大肠杆菌感受态细胞 DH5 的制备，质粒的转化及提取一 实验目的1， 了解和掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法的原理和操作技术。2， 了解和掌握质粒转化的原理和操作步骤。3， 掌握碱裂解法提取质粒的原理和方法，以及提取过程中各试剂的作用。二 实验原理1， 大肠杆菌感受态细胞制备的原理感受态是细菌细胞具有的能接受外源 DNA 的一种特殊生理状态，将正在生长的大肠杆菌处于 0的 CaCl2低渗溶液中，会膨胀成球形，细胞膜的通透性发生变化，此时的细胞呈现出感受态。2， 质粒转化原理在 0下外源 DNA 可吸附到感受态细胞表面，短时间的热刺激可诱导细胞吸收 DNA。转化了质粒 DNA 的大肠杆菌经培养可
2、以使质粒编码的抗生素抗性基因得到表达，因此，转化了质粒的大肠杆菌细胞可以在含有相应抗生素的培养基上涂布生长，而没有转化的细胞则无法生长。3， 质粒提取原理质粒的分离是利用质粒 DNA 与染色体 DNA 在变性与复性中的差异来达到的目的。当菌体在 NaOH 和 SDS 溶液中裂解时，蛋白质与 DNA 发生变性，由于染色体 DNA 与质粒DNA 拓朴构型不同,染色体 DNA 双螺旋结构解开，而共价闭环质粒 DNA 的氢键虽被断裂，但两条互补链彼此相盘绕仍会紧密地结合在一起。当加入中和液后, 溶液 pH 调恢复至中性，在高盐浓度的情况下，染色体 DNA 之间交联形成不溶性网状结构并与蛋白质-SDS
3、复合物等形成沉淀；不同的是，质粒 DNA 复性迅速而准确，保持可溶状态而留在上清中。这样，通过离心可沉淀大部分细胞碎片、染色体 DNA、RNA 及蛋白质。除去沉淀后上清中的质粒可用酚氯仿抽提进一步纯化质粒 DNA。三 仪器，材料及试剂仪器：恒温培养箱，离心机，恒温摇床，超净工作台，高压灭菌锅，电泳仪，水浴锅等材料：大肠杆菌 DH5 菌株，大肠杆菌 BL21 菌株，pCMV 质粒试剂：Solution I，Solution II，Solution III，1 mol/L CaCl2，TE 缓冲液，70%乙醇，酚：氯仿（1:1）等。四 实验步骤1，试剂的准备Solution I: 1，量取下列溶液
4、，置于 1L 烧杯中。1MTris-HCL(pH8.0) 25 mL0.5 M EDTA(pH8.0) 20 mL20Glucose（1.11M） 45 mLdH2O 910 ml 2，高温高压灭菌后，4保存。Solution II：1，量取下列溶液，置于 500mL 烧杯中。10SDS 50mL2N NaOH 50mL2，加灭菌水定容至 500 mL，充分混匀。Solution III：1，量取下列溶液，置于 500mL 烧杯中。KOAc 147gCH3COOH 57.5 g2，加入 300ml 去离子水后搅拌溶解。3，加去离子水将溶液定容至 500。4，高温高压灭菌后，4保存。LB 培养基
5、： 1，称取下列试剂，置于 1L 烧杯中。Tryptone 10gYeast Extract 5gNaCl 10g2，加入约 800ml 的去离子水，充分搅拌溶解。3，滴加 5NNaOH（约 0.2ml） ，调节 pH 值至 7.0。4，加去离子水将培养基定容至 1L。5，高温高压灭菌后，4保存。10TE Buffer：1，量取下列溶液，置于 1L 烧杯中。1 M Tris-HCl Buffer（pH8.0） 100ml500mM EDTA（pH8.0） 20ml2，向烧杯中加入约 800ml 去离子水，均匀混合。3，将溶液定容至 1L 后，高温高压灭菌。4，室温保存。2 感受态细胞制备1）从
6、-80冰柜中取出一支冻存的大肠杆菌 DH5菌株，在冰块上解冻后，于事先照过紫外的超净台中，用无菌接种环轻轻蘸取菌种后，在无抗平板上分区划线，将菌种迅速放回-80保存。平板做好标记后，于 37培养约 16 小时,该细菌菌落在 LB 培养基上为 1-2mm的透明的淡黄色菌落，有特殊的臭味。2)在照过紫外的超净台中，用灭菌的牙签挑取单个菌落，接种入装有 1mlLB 培养液的1.5mlEP 管中，封口膜封好，于 37恒温摇床培养 10-12 小时，直至对数生长期。3）将该时期的细菌悬液转接于 100mlLB 液体培养液中，37，220rpm ，震荡扩大培养约3h，测细菌 OD600，以 0.3-0.4
7、 之间最佳。4）将扩大培养后的培养物在冰上冷却 10min，转入 50ml 离心管，4,4000rmp 离心10min。5）倒净上清液，流尽残余液体，加入 10ml 预冷的 0.1mol/L 的 CaCl2 溶液（使细菌膨胀成球形，外源 DNA 分子在此条件下易形成抗 DNA 酶的羟基-钙磷酸复合物粘附在细菌表面）轻轻悬浮细胞，冰浴 30min。6）4,4000rmp 离心 10min。7）弃去上清，加入 2ml 预冷的 15甘油的 0.1mol/L 的 CaCl2 溶液再次悬浮细胞，即制成了感受态细胞悬液。8）每个 1.5mlEP 管分装 200l的感受态细胞，-70 保存。3 转化1）将感
8、受态细胞从-70拿出，放冰块上解冻。2）在超净工作台中，取空质粒 1l加去离子水 9l稀释，加入到 100l感受态细胞中，冰上放置 30min。3）42,热激 60s（促进细胞对 DNA 的吸收） ，迅速再在冰上放置 3min。4）加入不含 Amp 的 LB 培养液 890l，37振摇 1h，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗性基因（Amp） 。5）从每管中取 100l培养液铺至 LBAmp 培养板，并涂布均匀。6）室温放置 20min，使液体吸收，37倒置培养 16h。7）挑取单个菌落，接种于加有 Amp 的 2mlLB 培养液中，37，220rpm ，震荡培养约16h。4 质粒提取
9、（碱裂解法）1）加 1.5ml 培养物于离心管中，4,12000rmp/min 离心 30s。2）倒去上清液，倒置于吸水纸上干燥。3）加入 100l4预冷的 Solution I 重悬，用手剧烈震荡 15s。 （低浓度的葡萄糖溶液使细胞处于低渗状态而细胞膨胀；葡萄糖的作用是增加溶液的粘度，减少抽提过程中的机械剪切作用，防止破坏 DNA。EDTA 的作用是螯合掉 Mg2+、Ca2+ 等二价金属离子，防止 DNA酶对质粒分子的降解作用。TrisCl 能使溶菌液维持溶菌作用的最适 PH 范围） 。4）缓慢加入 200l新配制的 Solution II，上下颠倒 5 次。 （SDS 的作用：破坏细胞膜
10、；解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性。NaOH(pH12)的作用：破坏氢键，使 DNA 分子变性） 。5）加入 150l用冰预冷的 Solution III，盖紧管口，上下颠倒 10 次，放冰上 3-5 分钟。 （：由 KAc 与 HAc 组成，是 pH 值为 5.5 的高盐溶液。能中和溶液 II 的碱性，使 DNA 复性。K+离子会与 SDS 形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去。溶液中的染色体 DNA也会与蛋白质-SDS 形成相互缠绕的大分子物质，很容易与小分子的质粒 DNA 分离） 。6）4,12000rmp/min 离心 5min，吸上清 400l移到另一离心管中。7）加等量酚
11、:氯仿(各 200l） （使蛋白质变性，并使液相和有机相分离） ，震荡 15min。8）4,12000rmp/min 离心 2min，将上清液移到另一离心管，切勿吸到下层溶液，取 300l即可。9）加入 2 倍体积的无水乙醇（夺取 DNA 外的水合层使 DNA 聚合而沉淀） ，室温放置2min，4,12000rmp/min 离心 5min，上下颠倒 5 次使其反应充分。10）弃去上清，将离心管倒置于吸水纸上。11）加入 1ml70乙醇（与无水乙醇的作用类似，同时可以清洗 DNA，溶解与 DNA 一起沉淀下来的离子。 ） ，用枪头把沉淀吸起来，4,12000rmp/min 离心 2min。12）
12、弃上清，倒置于吸水纸上。13）各加入 1lRNase（降解 RNA 污染物） ，30lTE 。14）封口膜封上，37孵育 1h。5 琼脂糖凝胶电泳结果用微量分光光度计测质粒浓度，浓度在 2000ng/l时进行琼脂糖凝胶电泳。1）制备琼脂糖凝胶：称取 0.8g 琼脂糖，加入 100ml1TAE 缓冲液，置微波炉中加热至完全融化，取出摇匀，即为琼脂糖凝胶液，冷却至 50-60后倒入到放有梳子的有机玻璃内槽中，形成一层均匀的胶面，凝固后，拔出梳子，放入加有电泳缓冲液的电泳槽中。2）加样：第一孔加入 6lMarker，其余几孔加入混有 loading buffer 的质粒。3）电流 80mA，电压 1
13、10V，电泳 40min。4）电泳结束后看结果。五 结果分析M： 2000 DNA marker2,5,8 孔为转化入 BL21 细菌的质粒。1,3,4,6,7,9,10 孔为转化入 DH5细胞的质粒。正常质粒是闭合的双链 DNA。在提取过程或电泳过程中可能使质粒发生开环，或者由开环解开螺旋变成线形。这三种形态电泳时的分离率不同，分离速度不同，分成三带。闭环（超螺旋） ，开环，线形的螺旋率依次降低。另外，质粒提取过程中可能被外源 DNA 污染，出现其他条带。本实验结果中 2,5,8 孔为转化入 BL21 细菌的质粒。BL21 细菌为表达型的细菌，表达型的菌株提质粒经常会有质量不高或者背景的问题，可能为没有条带的部分原因。M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
