《前列腺素e1阻止大鼠脊髓背侧角表面神经细胞凋亡》由会员分享，可在线阅读，更多相关《前列腺素e1阻止大鼠脊髓背侧角表面神经细胞凋亡（11页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1Pergamon 神经药理学，36 卷；8 期，第 10231030 页，1997 年Elsevier 科技有限公司，版权所有印刷地为英国00283908/97 17.00 美元前列腺素 E1 阻止大鼠脊髓背侧角表面神经细胞凋亡 日本大阪绿十字公司中心研究实验室（1997 年 5 月 15 日接受）摘要在形态学和组织化学方面，神经元变性与神经元坏死之间有显著差别。本研究通过慢性缩压大鼠坐骨神经来诱导腰椎脊髓背侧角神经元变性。在接受坐骨神经外源兴奋刺激的脊髓区域神经元细胞出现凋亡，凋亡经 TUNEL-染色和基因组 DNA 电泳得以证实。凋亡神经元的形态学改变包括经甲苯胺蓝染色后有黑神经元出现。
2、为保持化学成分稳定及能够定向运输，将 PGE1 装入脂质体微囊，10g/kg 的前列腺 E 受体拮抗剂脂质体-PGE1 几乎能阻断所有黑神经元的产生，而同样剂量和剂型的前列环素（IP）受体拮抗剂羰环素则无此作用。脂质体-PGE1 也能够阻断脊髓受累区域组织基因组 DNA 片段电泳“梯子”的形成。由于慢性损伤和有扩张作用的前列腺素都不会影响脊髓下局部区域的血流量，脂质体-PGE1 的作用一定是通过其他机制来实现的。本研究结果表明，EP 受体拮抗剂 PGE1 能有效阻断坐骨神经缩压性损伤造成的神经元凋亡，而 IP 受体拮抗剂羰环素则无此作用。1997 年 Elsevier 科技有限公司。关键词前列
3、腺素 E1，凋亡，黑神经元，脊髓，坐骨神经缩压损伤，前列腺素E(EP)受体神经元凋亡目前已成为神经科学研究领域的主要任务之一。在各种神经系统疾病中，阿尔茨海默病、帕金森病和肌萎缩性脊髓侧索硬化病都具有特定神经功能缓慢丧失的特点，这种现象可能是由凋亡造成的（Craig， 1995） 。近年来，一些与凋亡诱导(Miura et al., 1991; White et al., 1994)或抑制（Gregory et al., 1991； Gonzalez-Garcia., et al., 1994）相关的转录因子基因相继得以克隆。此外，有些细胞内信使与细胞核损伤的诱发和抑制密切相关（Schultz
4、e et al., 1994；Ojeda et al., 1995） 。有报道称，细胞内环-AMP 浓度的升高可以通过与坏死不同的方式导致细胞死亡（Weiss et al., 1995） 。不过，也有报道称环 -AMP 能够抑制细胞凋亡（Alok et al., 1994） 。有关环-AMP 在介导凋亡过程中的作用还存在争议。前列腺素（PG）E1/E2 和前列环素（PGI2）通过活化鸟苷酸结合蛋白 Gs 使细胞内环 AMP 的浓度升高（ Gilman， 1984；Schramm 和 Selinger） ，这可能也会对细胞凋亡有影响。例如，PGE2 能抑制淋巴瘤细胞的凋亡（ Goetzl et
5、al., 1995） ，但却能启动胸腺细胞的自杀程序（Saiagh et al., 1994） 。对于神经元的凋亡，PGE1/E2 或 PGI2 的作用目前尚不明了。2前列腺素受体基因最近相继得以克隆，通过 Northern Blot 和原位杂交分析已基本搞清了前列腺素受体的定位。神经元细胞表面存在 EP 和 IP 受体（Sugimoto et al., 1990a； Sando et al., 1994） ，因此推测二者在神经元生理调节方面发挥重要作用。例如，突触有可能就是主要由前列腺素介导的神经元组成之一（Yamagata et al., 1993） 。因此，前列腺素样拮抗剂有可能具有介导
6、神经元变性的药理作用，如凋亡。脂质体-PGE1 是一种包被型 PGE1，它是一种 EP 受体拮抗剂，脂质体微球可以延长 PGE1 的半衰期，并能使药物进行靶向运输而发挥作用（ Mizushima和 Hoshi, 1993） 。对于糖尿病神经变性（Toyota et al., 1993; Tawata et al., 1991） 、神经性疼痛（Kamiyama et al., 1991）和周围动脉阻塞性疾病（ Mizushima et al., 1987） ，目前已有关于脂质体-PGE1 治疗有效的报道。将坐骨神经造成慢性缩压性损伤（Bennett 和 Xie， 1988） ，我们以大鼠脊髓为模
7、型对缺血依赖性神经变性（包括黑神经）进行了研究，并对比了脂质体-PGE1 和化学成分稳定的 IP 受体拮抗剂羰环素的不同作用。表 1. 目标脊髓神经元区非缺血性神经变性的证据治疗方法 剂量（g/kg）血流量（ml/min/100g 组织）空白对照 6.90.7空载体 7.90.5脂质体-PGE1 1 7.40.63 6.60.810 7.02.3羰环素 1 7.50.23 6.30.410 7.20.4利用激光多普勒技术检测腰椎四五段脊髓背侧角的脊膜局部血流。数据表示为SEM（源于四只大鼠测量结果） 。在 14 天缩压性坐骨神经损伤过程中同时给予脂质体-PGE1 或羰环素，结果局部脊膜血流量无
8、变化。材料和方法采用苯巴比妥钠腹膜内注射法（40mg/kg）麻醉雄性 Wistar 大鼠（200250克） 。用四条软绷带缓慢勒紧坐骨神经诱发神经变性（Bennett 和 Xie，1988） 。3将股二头肌钝性分离，暴露粗大的坐骨神经。在坐骨神经近端至三叉分支处大约 7 毫米长的神经通路上将粘附的组织剥离，按 1 毫米间距将 4 条绷带（4.0 铬肠线）宽松地系到神经上。其中一组采用单侧空白手术（仅暴露坐骨神经，但不进行结扎） 。术后每日一次静脉注射脂质体-PGE1 和 PGI2-类似物羰环素，用药总时长为两周。实验动物一共分七组：脂质体-PGE 11g/kg、脂质体 -PGE13g/kg 和
9、脂质体-PGE 110g/kg 剂量组；羰环素 1g/kg、羰环素 3g/kg 和羰环素 10g/kg 剂量组；空载体组。用药结束第 2 天，腹腔内注射苯巴比妥钠（40mg/kg）麻醉动物，显微手术暴露腰椎 L4L5 段。激光多普勒检测仪检测局部血流量（高级激光流量检测仪，ALF2100, 日本） 。上述检测完成以后，分离腰椎脊髓，在 L4 和 L5 之间将脊髓反向离断成两段。将含 L4 一端的胸椎段（T13）作为阴性对照，于-70C 冷冻以备基因组DNA 电泳分析。包含 L5 的另一脊髓段置于 10福尔马林中性缓冲液中浸泡，用作甲苯胺蓝染色或 TUNEL 分析。利用基因组 DNA 纯化试剂盒
10、（BIO 101 Inc., CA， U.S.A.）纯化分离胸段和腰段脊髓基因组 DNA，然后进行电泳分析。纯化后的基因组 DNA 样品与低熔点琼脂糖凝胶混合，然后加入到干燥的 2（w/v）琼脂糖凝胶孔中。将取自L4 和 L3 脊髓段的 10 微克的总 DNA 进行电泳分离，然后用溴化乙啶染色观察。甲苯胺蓝染色法识别黑神经元。另一半取自 L4L5 的脊髓段在 2的 OsO4中浸泡 2 小时，梯度乙醇脱水，环氧树脂包埋。每一个脊髓段每 100m 制一个厚度为 5m 的组织切片，并将组织切片置于载玻片上以明胶封片。然后以浓度为 1甲苯胺蓝和 1硼酸钠的水溶液在 65C 条件下染色 2.5 分钟。为
11、确保每一份标本上所计数的细胞总数相同，在显微镜下以 2.8104m2 面积内的全部黑的或凋亡神经元细胞的绝对数来计算细胞的变性率。所观察区域的细胞数在 247895 之间。在不同的给药组之间，以及给药组和对照组之间，细胞总数无显著差别。用 C-成像系统 （Compix Inc.,PA, U.S.A.）计数细胞数量。4在分析 DNA 片段时，将另一半主要含 L5 的脊髓组织段脱腊，用于特殊标记进行原位杂交分析 DNA 碎片（用生物素化 dUTP 进行 TUNEL 染色；Gavrieli et al., 1980） 。以四只大鼠的测量结果作为实验结果，记录为均数SEM。采用 Dunnett 法或
12、t-检验分析分别计算空白载体组和不同药物组，空白手术组和坐骨神经缩压损伤组以及空白载体组之间的统计学差别。如 p 值小于 0.05，则认为组间差异显著。结 果术后两周，任一实验组的腰椎侧角脊膜血流量无明显变化（见表 1） 。实验初期（第 1 和第 5 天） ，脊膜局部血流量的基础值稍低，但变化不明显，在 6.5和 8.0ml/min100g 之间波动。前列腺素类药物的应用对每日测量的血流量无影响（数据未显示） 。在空白手术组，黑神经元出现率极低（图 1A 和 2） 。单侧缩压损伤的大鼠，同侧腰椎侧角第 1 段和第 2 段组织切片上的黑神经元发生率增加了八倍（图 1B和 2） 。在脂质体-PGE
13、1 组，同一区域黑神经元发生率非常低，与空白手术组的黑神经元数相比，二者无显著差异（图 1C 和 2） 。但羰环素对脊髓伤侧黑神经元的出现率没有影响（图 1D 和 2） 。图 1.显微镜下观察大鼠腰椎脊髓侧角表面出现的黑神经元和前列腺素类物质的抑制作用。与空白手术组健康脊髓神经元（A）相比，空白载体组（ B）在慢性坐骨神经缩压伤后第 14 天，黑神经元经甲苯胺蓝染色后呈现黑色颗粒样表现。在慢性坐骨神经缩压伤的 145天中，同时给予脂质体-PGE1 （10g/kg/d） ，能够抑制黑神经元的出现（ C） 。但在慢性坐骨神经缩压伤的 14 天中如同时给予羰环素（10g/kg/d） ，则对黑神经元的
14、出现完全没有抑制作用。6图 2.坐骨神经缩压性损伤同侧（左侧条形图）及对侧（右侧条形图）腰椎脊髓侧角黑神经元的出现率增加的情况以及前列腺素类物质的抑制作用。条形图代表的是四只大鼠的实验结果，表示为均值SEM 。分别采用 t-检验和 Dunnett 法计算慢性缩压性损伤组、空白载体对照组、空白手术组（ *p0.01）或慢性缩压损伤组以及给药组（ *p0.01）之间的统计学差异。与对侧相比，在一定观察面积内（2.810 4m2） ，缩压损伤同侧的腰椎脊髓黑神经元的发生率明显增高。连续 14 天给药以后，脂质体-PGE1 能以剂量依赖性的方式阻断上述现象，但羰环素则对神经变性无明显抑制作用。图 3
15、胸椎脊髓和腰椎脊髓侧角基因组 DNA 的电泳图。图中的电泳条带分别代表以下样品：DNA 分子量标准（第 1 带） ，来源于胸椎脊髓 13 段的 DNA（第 2 带） ，经 14 天坐骨神经缩压性损伤的大鼠腰椎脊髓第 4 段侧角的基因组 DNA（第 3 带） 。每份 DNA 样品取 10 微克用于 2琼脂糖凝胶电泳分析，电泳后用溴化乙啶进行 DNA 染色观察。腰椎第4 段脊髓侧角接受来自坐骨神经的传入冲动，取自该段脊髓的基因组 DNA 呈现与核小体大小一致的条带；胸椎第 13 段脊髓不直接接受来自坐骨神经的冲动，取自该段脊髓的基因组 DNA 电泳后无碎片样表现。7图 4 坐骨神经经过 14 天缩
16、压性损伤后，同侧腰椎脊髓侧角 DNA 的碎片图形和脂质体-PGE1 的抑制作用。图中条带依次为以下样品的 DNA 电泳图形：分子量标准（第 1 带） ，空白手术组基因组 DNA（第 2 带） ；有坐骨神经缩压性损伤的空白载体组基因组 DNA（第3 带） ，取自有坐骨神经缩压性损伤动物经脂质体-PGE1 用药（ 1 和 10g/kg/d）后的基因组DNA（第 4 和第 5 带） ，取自有坐骨神经缩压性损伤动物经羰环素用药（1 和 10g/kg/d）后的基因组 DNA（第 6 和第 7 带） 。每份 DNA 样品取 10 微克用于 2琼脂糖凝胶电泳分析，电泳后用溴化乙啶进行 DNA 染色观察。动物在坐骨神经缩压性损伤的同时给予 14 天的脂质体-PGE1（1，10g/kg/d）能够阻止基因组 DNA 出现碎片条带，但无论羰环素剂量如何改变，它都不具有这种预防
