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1、上海欣软信息科技有限公司 网站： 电话：021-60830374动物行为学实验设计方法第一节 概述行为是基因与环境相互作用的结果。基因的变化（如转基因，基因敲除或下调等）最终表现为与基因相关的行为变化；环境的变化（如声、光、电的刺激和药物的处理）不仅其本身可直接影响动物的行为，而且可通过对相关基因的影响而改变动物的行为。学习和记忆更是这种相关基因与环境相互作用的行为表现的一种形式。学习是一个获得外界环境信息（对动物而言）或有关世界知识（对人类而言）的过程；记忆则是对这种信息或知识进行加工（encoding） 、储存（ storage）和再现（retrieval）的过程。人类的记忆复杂，包括对事
2、件与物体的明晰记忆（explicit memory）或描述性记忆（declarative memory）和与学习无关（如适应性和敏感性）或有关（如操作技术和习惯养成）的模糊记忆（implicit memory）或非描述性记忆（nondeclarative memory） 。而动物记忆相对较为简单，包括短期记忆（shortterm memory）和长期记忆(long-term memory)；前者一般持续几分钟到几小时，后者则持续 24 小时到数天.数周甚至更长时间。与此相对应得是工作记忆(working memory)和参考记忆(reference memory)。工作记忆是将获得的信息进行加
3、工并储存较短的时间，因而代表短期记忆；参考记忆是指对在整个实验过程中（测试的任何一天）均有用的信息进行加工储存的过程，因而代表长期记忆。记忆的脑机制非常复杂，迄今仍不清楚。早在 20 世纪 40 年代末，著名神经外科医生Wilder Penfield 第一个获得证据表明，记忆的加工可能是在人脑的某些特殊部位进行。他从上千例的病人观察到，电刺激病人的脑颞叶皮层（temporal lobes）会产生一连串对早期经验的回忆，病人称之为“经验反应” （experiential response） 。几年后一次偶然的机会，为了给一个患癫痫长达 10 年的病人施行脑手术治疗，Penfield 将病人双侧的
4、海马杏仁核和部分颞叶皮层切除。术后发现，病人的癫痫症状大为改善。但出乎意料的是，病人的记忆同时受到破坏性的损害。虽然病人保留了几秒到几分钟的短期记忆，且对手术前的事件有非常好的“长期记忆” ，但是，他却不能将短期记忆转化为长期记忆。对人地点或物体等信息的保持不超过一分钟。而且，他的空间定位能力也大大受到削弱，甚至花了长达一年时间才学会走一条围绕一栋新房的路而不至迷路。事实上，所有因手术或疾病使内侧颞叶的边缘结构受到广泛损害的病人都具有类似的记忆缺陷。这些结果说明，大脑边缘系统在记忆调节中发挥重要作用。此后近半个世纪的研究表明，脑内至少存在 5 个不同的结构系统相对特异性地参与学习记忆的调节，包
5、括海马、杏仁核、皮层（尤其是鼻周皮层，perirhinal cortex） 、小脑和背侧纹状体。针对这些脑结构建立了相应的具有一定特异性地学习记忆的行为测定方法。海马是空间记忆的最重要的调节脑区，同时也参与情绪记忆的调节。毁损海马回导致空间记忆的完全缺失，情绪记忆也会减弱，但不会完全消失。这是因为情绪记忆主要由杏仁核调节。测定杏仁核依赖的记忆主要用条件恐惧（fear conditioning）法；而测定海马依赖的记忆方法则很多，包括各种迷宫和抑制性回避(inhibitory avoidance)实验等。鼻周皮层是调节视觉物体记忆（visual object memory） 的特异性闹区，常用物
6、体认知模型（ object recognition）检测。小脑是调节与骨骼肌反应有关的经典反射的特异性脑结构，眨眼反应（eyeblink conditioning）模型对小脑依赖的记忆有很高的特异性。纹状体对刺激- 反应习惯（stimulus-response habit）的学习记忆过程其重要作用，主要调节与药物滥用有关的学习记忆。测定纹状体记忆的方法很少，目前主要用赢-留放射臂迷宫（win-stay radial arm maze）法。纹状体毁损会导致动物在这一模型上的记忆操作障碍，而毁损海马或杏仁核对这种记忆没有明显影响。说明赢-留放射臂迷宫法对纹状体记忆具有特异性。尽管记忆的发生机制仍不
7、清楚，但越来越多的证据表明，环磷酸腺苷-蛋白激酶上海欣软信息科技有限公司 网站： 电话：021-60830374A（cyclic AMP-protein kinaseA,Camp-PKA）信号系统对记忆起着重要的调节作用。激活与刺激性 G 蛋白（Gs）相偶联的受体会刺激腺苷酸化酶的活性，因而使 cAMP 形成增多，并激活 PKA.PKA 使 cAMP 反应单元结合蛋白（cAMP-responsive-element-binding protein, CREB）磷酸化并激活，从而促进与记忆相关的基因表达，最终使记忆增强。此外，分裂素激活蛋白激酶/细胞外信号调节激酶（ mitogen activa
8、ted protein kinase,MAPK/extracellular signal-regulated kinase,ERK）信号通路也以类似的磷酸化方式调节 CREB 的活性，进而调节记忆。因此，除了用脑部结构毁损的方法从解剖上去除某一特定的脑内结构对记忆的调节功能以外，凡是能影响上述信号通路功能的药物（如 NMDA 受体拮抗剂 MK-801 和MEK 抑制剂 U0126 减弱记忆；4-型磷酸二脂酶（type-4phosphodiesterase,PDE4）抑制剂则增强记忆）或有关的处理（如转基因或基因敲除或下调）均可影响学习记忆过程。学习记忆研究是当今生物医学界最为热门的领域之一。这
9、方面的发展可谓日新月异。新的或经改良的研究方法和手段层出不穷。因此，本章不可能把所有有关学习记忆的研究方法逐一进行描述，只是选择一些有代表性的常用方法加以介绍。此外，所用仪器设备也不只局限于本章所介绍的内容。在同一实验中，不同实验室所用仪器设备会有所不同，但实验结果应该一致。第二节 迷宫一、Morris 水迷宫本实验由美国科学家 Richard GM Morris 于 1981 年建立。最初用于研究脑内结构对学习和记忆的调节作用，后来逐步发展成为目前最为常用的评价动物学习与记忆的模型。这一实验的基础是，啮齿类动物在水中有强烈的逃避水环境的动机，并以最快、最直接的途径逃离水环境。学会逃避水环境的
10、过程体现动物的学习能力；根据周围环境进行空间定位，有目的地游往水中安全的地方（平台） ，体现动物的空间记忆能力。（一） 实验设备实验用大鼠或小鼠进行。大鼠水迷宫实验设备由上海欣软信息科技有限公司制作，包括一个灰色或黑色圆形水池（直径 200cm，高 100cm；小鼠规格尺寸减半） 、一个平台（直径10cm） 、一台跟踪摄像机以及摄像机相联的计算机（图 25-1） 。池内盛水，深 50cm，水温为摄氏 2224。平台置于水面下 2cm（小鼠为 1cm） 。在水中加入奶粉或牛奶将水搅浑以免让动物看清水下平台。摄像机位于水池中央上方 200cm，可记录动物的位置、游泳距离和时间（从而可计算出游泳速度
11、）以及游泳路径等。房间周围墙壁上贴上色彩鲜明、形状不同的图画用为迷宫外暗示（extra-maze cues） 。（二） 实验方法 分获得性训练、探查和对位训练 3 个过程。1获得性训练（Acquisition phase）理论上将水池分为 4 个象限，平台置于其中一个象限区的中央。（1） 将动物（大鼠或小鼠）头朝池壁放入水中，放入位置随机取东、西、南、北四个起始位置之一。记录动物找到水下平台的时间（s） 。在前几次训练中，如果这个时间超过 60s，则引导动物到平台。让动物在平台上停留 10s.（2） 将动物移开、擦干。必要时将动物（尤其是大鼠）放在 150W 的白炽灯下烤5min，放回笼内。每
12、只动物每天训练 4 次，两次训练之间间隔 1520min,连续训练5d。2探查训练(probe trial 1) 最后一次获得性训练结束后的第二天，将平台撤除，开始 60s的探查训练。将动物由原先平台象限的对侧放入水中。记录动物在目标象限（原先放置平台的象限）所花的时间和进入该象限的次数，以此作为空间记忆的检测指标。3对位训练（reveral phase） 测定动物的工作记忆（working memory） 。探查训练结束后的第二天，开始维持 4 天的对位训练。将平台放在原先平台所在象限的对侧象限，方法上海欣软信息科技有限公司 网站： 电话：021-60830374与获得性训练相同。每天训练
13、4 次。每次记录找到平台的时间和游泳距离以及游泳速度。4对位探查训练（probe trial 2）最后一次对位训练的第二天进行。方法与上述探查训练类似。记录动物 60s 内动物在目标象限（平台第二次所在区）所花时间和进入该区的次数。（三） 注意事项1对比食物驱动的模型（如放射臂迷宫） ，水迷宫实验的最大优点在于，动物具有更大的、逃离水环境的动机。而且不必禁食，特别适合老年动物的测试。加上它对衰老引起的记忆减弱尤其敏感，因此，水迷宫最常用于老年动物记忆的研究。2如用小鼠，除游泳池尺寸约为大鼠的 50%以外，平台直径也较少（7.5cm） 。实验方法与大鼠类似，但训练周期较短。一般获得性训练 3 天
14、共训 16 次（第一天 4 次，后两天每天6 次；两次训练之间的间隔 510min，第四天为探查训练，第五、六天为对位训练，每天训练六次，第七天为第二次探查训练。3.如用肉眼观察，在所有试验过程中试验着始终坐在同一位置，距离泳池最近的边缘约60cm。4每天在固定时间测试。操作轻柔，避免不必要的应激刺激。5当与其他同类实验相比较时，要注意到动物的性别、品系、泳池的尺寸和水温等多种因素对实验结果的影响。此外，当以游泳速度作为观察指标时，要考虑到动物的体重、年龄以及骨骼肌发育状况等对游泳速度可能造成影响。6用老年动物进行实验时，应确认动物的游泳能力和视力不因年龄增大而影响行为操作。其方法如下：将平台
15、露出水面以使动物能够看见平台。动物放入泳池后如毫无困难地直接游向平台，说明动物的游泳能力和视力均正常，可以开始实验。7游泳对动物是一个较大的应激刺激，可引起神经内分泌的变化。这些变化可能对实验结果造成干扰。对老年动物，严重时可诱发心血管疾病而导致卒中甚至死亡。因此，必要时可将动物多次放入泳池或适当延长其游泳时间以增加动物对游泳的适应能力。8当用牛奶或奶粉搅浑泳池的水时，要定期换水以免水腐败变质；如用白漆达到同样目的时，必须确保白漆对动物没有毒性。二、 放射臂迷宫放射臂迷宫（radial arm maze）实验也是最为常用的评价动物学习记忆能力的模型之一，由 Olton 等人于 20 世纪 70
16、 年代中期建立。其基本依据是，控制进食的动物受食物的驱使对迷宫各臂进行探究；经过一定时间的训练，动物可记住食物在迷宫中的空间位置。该方法可同时测定动物的工作记忆（working memory）和参考记忆（reference memory） 。所用动物包括大鼠、小鼠和鸽子。这一模型对脑区毁损和多种药物均很敏感。后者包括乙醇、东#（抗胆碱能药）和 MK-801(NMDA 受体拮抗剂) 等。（一） 实验设备 实验多数采用八臂放射迷宫，也有采用 十二臂或者二十四臂迷宫。这里介绍上海欣软信息科技有限公司生产的八臂迷宫。每个臂长 41.9cm，宽11.4cm，高 10.1cm；其上有一透明盖，两侧各有两个相对的光电管。迷宫中央八角形区的直径为 27.4cm；上有一透明顶盖。中央区通往各臂的入口处有一活动门，用来对动物的出入臂进行控制。迷宫与计算机相联。也可用摄像跟踪系统（video tr
