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1、琼脂糖凝胶电泳（一）材料电泳仪、水平电泳槽、样品梳子、琼脂糖等（二）试剂1、 1*TAE2、 EB 溶液： 100mL 水中加入 1g 溴化乙啶，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，分装，室温避光保存。3、 DNA 加样缓冲液： 0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，50%甘油（w/v ） 。4、 RNA 甲醛变性胶上样缓冲液： 0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，1mM EDTA(PH8.0)，50%甘油（w/v） ，用 DEPC 水配制，高压灭菌备用。5、 5*甲醛变性胶电泳缓冲液：0.1m MOPS(PH7.0)，40mM 醋酸钠，5mM EDTA(PH8.0)，用 DEPC 水配制，过滤
2、除菌，室温避光保存。淡黄色缓冲液可正常使用，深黄色应弃用。1 制备琼脂糖凝胶：称取琼脂糖，加入 1x 电泳缓冲液，待水合数分钟后，置微波炉中将琼脂糖融化均匀。在加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液；加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。2胶板的制备 ：将胶槽置于制胶板上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持 1mm 左右的间隙，待胶溶液冷却至 50左右时，加入最终浓度为 0.5 微克 /毫升的 EB(也可不把 EB 加入凝胶中,而是电泳后再用 0.5g/ml 的EB 溶液浸泡染色 15 分钟) ，摇匀，轻轻倒入电泳制胶板上，除掉气泡；待凝胶冷却凝固后，垂直轻拔梳子；
3、将凝胶放入电泳槽内，加入 1x 电泳缓冲液，使电泳缓冲液液面刚高出琼脂糖凝胶面；3加样：点样板或薄膜上混合 DNA 样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于 1X。用 10 L 微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。 （注意：加样前要先记下加样的顺序和点样量） 。4电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，DNA 的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过 5V/cm。当琼脂糖浓度低于 0.5%，电泳温度不能太高。样品由负极（黑色）向正极（红色）方向移动。电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低。当溴酚蓝移动到距离
4、胶板下沿约 1cm 处时，停止电泳。5观察和拍照：电泳完毕，取出凝胶。在波长为 254nm 的紫外灯下观察染色后（2）的或已加有 EB 的电泳胶板。DNA 存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。于凝胶成像系统中拍照并保存之。（二） 在含有甲醛的凝胶上进行的 RNA 电泳（选做）配制 23 mL 甲醛电泳胶： 0.336g 琼脂糖溶于 20mL DEPC 水中，冷却至60?C，加入 5mL 的 5x 甲醛变性胶电泳缓冲液和 5.5mL 的甲醛，在通风橱内倒胶，冷却 30 分钟后使用。甲醛变性胶 RNA 样品的制备：1L RNA，5?甲醛变性胶电泳缓冲液 0.5L，甲醛 0.7L，甲酰胺 2L，6
5、5oC 加热 15min，迅速冰浴，加 1L 上样缓冲液和0.2L 的 EB。步骤：1 用 3%过氧化氢浸泡电泳槽、胶板、梳子 30 分钟以上。2 胶板的 制备 ：按常规琼脂糖电泳法。3 预电泳： 1甲醛变性胶电泳缓冲液，预电泳 10 min。电压为 5V/cm。4 小心地进行点样，记录样品次序与点样量；然后开始电泳，电压为 3-4V/cm。5 观察和拍照：在波长为 254nm 的紫外灯下观察电泳胶板并拍照保存图片。步骤1. 称量琼脂糖，转入耐热广口瓶内，加 TAE 用微波炉熔化。2. 用胶布封住电泳槽两端，插入梳子，平放于水平台上。3. 凝胶冷却到 50C-60C（手能触摸的温度）后倒入电泳
6、槽。4. 凝胶凝固后撕下胶布，直接（带上梳子）转移到电泳槽中。5. 加电泳缓冲液至充分没过凝胶。拔梳子时应谨慎。6. 阴极（黑色）一般位于右侧，阳极（红色）一般位于左侧。7. DNA 样品中加入点样缓冲液，混合均匀。然后小心加入到凝胶孔中。DNA样品；6*点样缓冲液 =5:18. 恒压电泳（6cm*9cm、0.7%凝胶用 80-100V 电泳 1h。溴酚蓝迁移到33%-66%时停止电泳） 。9. 浸泡于溴化乙锭溶液中。10. 电泳完毕后，将胶浸入到 EB 溶液中 10-30min。11. 在紫外发光仪上铺上保鲜膜，放入凝胶，打开紫外灯开关，观察。12. 拍照。【注意事项与提示】 （1）EB 是
7、强诱变剂并有中等毒性，易挥发，配制和使用时都应戴手套，并且不要把 EB 洒到桌面或地面上。凡是沾污了 EB 的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。简单处理方法为：加入大量的水进行稀释（达到 0.5mg/mL以下） ，然后加入 0.2 倍体积新鲜配制的 5%次磷酸（由 50%次磷酸配制而成）和 0.12 倍体积新鲜配制的 0.5mol/L 的亚硝酸钠，混匀，放置 1 天后，加入过量的 1mol/L 碳酸氢钠。如此处理后的 EB 的诱变活性可降至原来的 1/200 左右。（2）由于 EB 会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状 DNA，使DNA 迁移率降低。因此，如果要准确地测定 DNA 的分子量，应该采用跑完电泳后再用 0.5g/ml 的 EB 溶液浸泡染色的方法。（3）总 RNA 的分析：哺乳动物的 RNA 由 28S rRNA、18S rRNA 和 mRNA 以及其它小分子 RNA 组成，28S 和 18S rRNA 处为明显的亮带（相当于 4.5kb 和1.9kb） ， 28S/18S 应为 1.5-2.5/1；植物、昆虫、酵母和两栖动物的 RNA 带分布较小，约为 0.5-3.0kb 左右；假如 28S/18S 小于 1/1，或者出现拖带，说明RNA 已经有部分降解，如果 28S 和 18S rRNA 大部分已降解，则需重新 制备。
