《高产微生物油脂菌株培养基及发酵条件优化方法》由会员分享，可在线阅读，更多相关《高产微生物油脂菌株培养基及发酵条件优化方法（15页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、课堂报告名称：高产微生物油脂菌株培养基及发酵条件优化方法1、课堂报告依据的知识背景1.微生物细胞的化学组成微生物的六大营养素从元素水平还是从营养要素的水平来看，微生物的营养与摄食型的动物(包括人类)和光合自养型的植物非常相似，它们之间存在着“营养上的统一性”(表 5-1)。具体地说，微生物的营养要素有六种，即是碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水。2，微生物的分类在上述营养类型的分类中，其名称都是按能源和供氢体的顺序来表达的。上述四大类微生物的划分不是绝对的，它们在不同条件下生长时，往往可以互相转变。例如紫色非硫细菌在有光和厌氧条件下生长时，可以利用光来还原二氧化碳，这时它们属于光能自养型微
2、生物。但当它们在有机物存在的条件时，又可以利用有机物与光能生长，此时它们属于光能异养型微生物。异养微生物也不是绝对不能利用二氧化碳，它们当中有许多可以利用二氧化碳，只是它们不能以二氧化碳作为惟一碳源或主要碳源进行生长，而是在有机物存在的条件下也可以利用二氧化碳，将其还原成部分的细胞物质。自养微生物是能利用惟一碳源进行生长。但不是说它们绝对不能利用有机物进行生长。3. 营养物质进入细胞的方式、a单纯扩散不是微生物细胞吸收营养物质的主要方式，因为细胞既不能通过这种方式来选择必需的营养物质，也不能逆浓度运送营养物质。b 促进扩散只对生长在高营养浓度下的微生物发挥作用。c主动运送(active tra
3、nsport)是微生物吸收营养物质的主要方式，这种运送方式的营养物主要有无机离子、有机离子(如氨基酸)和一些糖类(如乳糖、蜜二糖或葡萄糖)等。的营养物主要有无机离子、有机离子(如氨基酸)和一些糖类(如乳糖、蜜二糖或葡萄糖)等。4. 培养基人类想要研究利用微生物，就必须先培养微生物。培养微生物要有适合微生物生长繁殖的环境条件，还要适宜的营养条件。由人工配置的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，称作培养基。 按用途分类：增殖培养基；选择培养基；鉴别培养基。 按状态分类：液体培养基；固体培养基；半固体培养基。 按化学成分分类：天然培养基；合成培养基；半合成培养基。 按目的分类：种子培养基；发
4、酵培养基。1）. 培养基包含成分a) 水：水分是微生物重要组成部分，微生物不能脱离水而生存，微生物所需的营养也只有溶于水才能很好地吸收，水利于调节细胞温度，保持细胞生活环境的温度恒定。水分为两种状态，自由水和结合水。前者以游离态存在，是细胞内的溶剂；后者与细胞内其他成分结合，不易蒸发，不冻结，不渗透，也不能作为溶剂。b) 碳源：提供为生物细胞组成和代谢产物中碳素来源的物质。提供微生物生长繁殖所需的能量。碳源分类很多，无机碳化合物有二氧化碳、碳酸盐等；有机含碳化合物，如糖类、醇类、有机酸、蛋白质及其分解产物。c) 氮源：可提供为生物细胞组成和代谢产物中氮素来源的物质。氮源用来合成氨基酸和碱基进而
5、合成蛋白质、核酸等细胞成分以及含氮代谢产物。氮源分类：1.分子态氮，存在大气中，仅有少数微生物可以利用；2.无机态氮，如铵盐、硝酸盐等，多数微生物可以利用；3.有机态氮，蛋白质及各种分解产物、尿素、嘌呤碱、嘧啶碱等。d) 能源：提供微生物生命活动过程中所需的能量来源的物质。异养微生物能源为碳源；自养微生物能源是日光。e) 生长因子：微生物不能自行合成，但生命活动又不可缺少的微量有机营养物质。功能：构成细胞的组成成分，如嘌呤、嘧啶是核酸的组成成分；调节代谢，维持正常的生命活动。自养微生物不需要生长因子，能自行合成；异养微生物有三种情况：有些异养微生物需要生长因子，如谷氨酸的短杆菌，需要添加生物素
6、才能使菌体生长良好；有些不需要生长因子；有些不但不需要还能在自身积累某些维生素，如肠道微生物分泌大量维生素供机体吸收利用，大肠杆菌合成维生素 K。f) 无机盐类：微生物生长过程中不可缺少的营养物质。从量的角度分主要元素和微量元素两大类。前者指磷钠硫钙镁铁等；后者锌锰钼钴等。作用：构成细胞组成成分，磷是核酸的组成元素之一；做酶的组成成分或酶的激活剂，铁是过氧化氢酶细胞色素氧化酶的组成成分，钙是蛋白酶激活剂；调节微生物的生长的物理条件，渗透压、氢离子浓度、氧化还原电位等；作为某些自养微生物的能源，如硫细菌以硫作为能源。g) 碳氮比：是指有机物中碳的总含量与氮的总含量的比，适当的碳氮比例，有助于微生
7、物发酵分解。碳氮比过高和过低都不利于细胞生长和外源蛋白表达和积累，过低导致菌体提早自溶；过高导致细菌代谢不平衡，最终不利于产物的积累。即使碳氮比处在合适水平，碳源和氮源浓度过高和过低也不利于细胞生长和外源蛋白表达和积累，浓度过高，细胞在发酵过程后期生长缓慢，代谢废物产生较多，最终使得菌体代谢异常，影响外源蛋白合成；浓度过低，培养基所能提供的营养物质有限，影响细胞的繁殖。因此培养基除了氮源碳源浓度适宜，还需要二者比例关系确定。h) PH 值：各类微生物生长的 PH 值不尽相同，环境中的 pH值对微生物的生命活动影响很大，主要作用在于：引起细胞膜电荷的变化，从而影响了微生物对营养物质的吸收；影响代
8、谢过程中酶的活性；改变生长环境中营养物质的可给性以及有害物质的毒性。每种微生物都有其最适 pH 值和一定的 pH 范围。在最适范围内酶活性最高，如果其他条件适合，微生物的生长速率也最高。大多数细菌、藻类和原生动物的最适 pH 为 6.5-7.5，在 pH 4-10 之间也可以生长；放线菌一般在微碱性即 pH7.5-8 最适合；酵母菌、霉菌则适合于 pH5-6 的酸性环境，但生存范围在 pH1.5-10 之间。有些细菌甚至可在强酸性或强碱性环境中生活。 。i) 渗透压：恰好能够阻止水分子通过半透膜从浓度较低的溶液移向浓度较高的溶液的在较高浓度溶液的液面上施加的额外压强称为渗透压。培养基内物质浓度
9、要合适。j) 氧化还原电位：一般，好氧微生物在氧化还原电位为正时都能生长，而厌氧微生物要求氧化还原电位为负值，其中严格厌氧微生物要求氧化还原电位在-400mV 以下2）.培养基配制的基本原则a. 要确定研究目的，明确微生物的营养类型，同时应该了解微生物的类群、生活环境；b. 应当查阅大量文献，总结借鉴前人工作经验；c. 具体问题具体分析，本着既要满足微生物的生长繁殖或积累大量代谢产物d. 要求，同时又要降低成本的原则，通常从培养基成分考虑，以配制生长繁殖所需的培养基。5.控制微生物的物理化学因素a灭菌，商业灭菌，消毒，防腐，无菌 b控制微生物的物理化学方法物理方法：温度，辐射，超声波，微波，过
10、滤除菌化学方法：重金属盐类，氧化剂，有机化合物，抗生素。 物理灭菌温度的代表高温 1、干热灭菌法 干燥热空气灭菌法：将物品放入烘箱内，然后升温至150170 ，维持 12 小时。适用于玻璃、陶瓷和金属物品的灭菌，不适合液体样品，及棉花、纸张、纤维和橡胶类物质的灭菌。 灼烧法：是将被灭菌物品在火焰中燃烧，使所有的生物质碳化。简单、彻底，但对被灭菌物品的破坏极大。适用于无经济价值的物品灭菌，及不怕烧的实验器具，如接种环、镊子、试管或三角瓶口的灭菌等。 特点：由于空气传热穿透力差，菌体在脱水状态下不易杀死，所以温度高、时间长。 2、湿热灭菌法100 以上的加压蒸汽进行灭菌。 同温同压和相同作用时间下
11、湿热比干热灭菌更好。 湿热对一般营养体和孢子的杀灭条件：1、多数细菌和真菌的营养细胞：在 60左右处理 510min；2、酵母菌和真菌的孢子：用 80以上温度处理；3、细菌的芽孢：121处理 15 分钟以上； 湿热灭菌法分类1、常压法（1）巴斯德消毒法 低温维持法： 63，30min 处理牛奶。 高温瞬时法： 72，15s 处理牛奶。（2）煮沸消毒法将水加热至 100，煮沸 15min30min，可杀死所有营养细胞和部分芽孢，达到消毒物品的目的。（3）间歇灭菌法（分段灭菌法、丁达尔灭菌法）过程如下： 80 100下蒸煮 15 60min（杀灭其中所有的微生物营养体） ； 室温或 37保温过夜（
12、诱使其中残存的芽孢萌发） ； 第二天再以同法蒸煮和保温过夜； 如此连续重复 3 天，即可在较低的温度下达到彻底灭菌的效果。 适用于不耐高温的物品灭菌，如不适于高压灭菌的特殊培养基、药品的灭菌。 缺点是麻烦、费时。 （2）连续加压蒸汽灭菌法（连消法）加压条件下，培养基在管道的流动过程中快速升温、维持和冷却，然后流入发酵罐。 优点：（1）可以减少培养基中的有效成分因长时间加热而遭受的破坏；（2）所用时间短，提高发酵罐的利用率；（3）提高锅炉使用效率；（4）适宜工业化生产 。 利用温度进行杀菌的定量指标 热死时间：在某一温度下，杀死某微生物的水悬浮液群体所需的最短时间。如： E.coli 在 60
13、下为 10min。 热死温度（热死点）：在一定时间内（一般为 10min） ，杀死某微生物的水悬浮液群体所需的最低温度。 多数细菌、酵母菌、霉菌的营养细胞和病毒，在5065 10min 即可致死。梅毒螺旋体 43 10min 即可致死。2、撰写课堂报告的目的1.了解微生物营养与生长的相关知识；2.了解培养基成分、类型；3.熟悉高产油脂微生物的种类；4.学会用培养基培养筛选需要的菌株；5.学会优化培养基发酵条件。3、撰写课堂报告的思路通过对微生物营养与生长相关知识的学习掌握，围绕高产油脂菌株培养基优化与培养条件优化这一研究问题，通过对高产油脂菌株的特点进行分析，寻找培养基优化和培养条件优化最佳方
14、法，初步构建高产油脂菌株的培养基与培养条件优化的方法体系。4、课堂报告的正文1.产油脂微生物1) 微生物油脂又称单细胞油脂，是酵母、霉菌、细菌和藻类等微生物在一定的条件下，以碳水化合物和普通油脂为碳源，在菌体内产生油脂。2) 常见产油微生物种类能生产油脂的微生物有酵母菌、霉菌、细菌和藻类等。其中真核的酵母菌、霉菌和藻类等能够合成与植物油组成类似的甘油三酯，而原核的细菌则合成特殊的脂类。目前研究的较多的是酵母菌、霉菌和藻类。现在用生产多不饱和脂肪酸的为真菌、细菌和藻类，由于细菌产量低，目前主要集中在真菌和藻类。微生物生产油脂不仅具有油脂含量高、生产周期短、不受季节影响、不占用耕地等优点；而且可用
15、细胞融合、细胞诱变等方法，使微生物产生高营养油脂或某些特定脂肪酸组成油脂，如 EPA、DHA、类可可脂等3）微生物油脂的产油机理 微生物产乍油脂的过程本质上与动植物产生油脂的过程相似，都是从利用乙酰 CoA 羧化酶的羧化催化反应开始，经过多次链的延长及经去饱和酶的一系列去饱和作用等，完成整个生化过程。4）高产油脂菌株生物量与油脂测定方法（1）菌体生物量测定：湿菌体于 60烘至恒重，以 g 干菌体，L 发酵液表示菌体生物量。（2）油脂测定方法：提油前菌体的处理采用酸热法破碎细胞，即在菌体中加入 4molL 的盐酸溶液沸水浴 20min，使细胞破碎。菌体油脂采用索氏抽提法，即用低沸点有机溶剂（乙醚
16、或石油醚）回流抽提，除去样品中的粗脂肪，以样品与残渣重量之差，计算粗脂肪含量。由于有机溶剂的抽提物中除脂肪外，还或多或少含有游离脂肪酸、甾醇、磷脂、蜡及色素等类脂物质，因而抽提法测定的结果只能是粗脂肪。 2.微生物油脂菌株培养1）高产油脂菌株的筛选用于生产微生物油脂的菌株要求具备以下条件：(1)具备或改良后具备合成油脂的能力，油脂积累量大，含油量稳定在 50%以上且油 脂转化率不低于 15%。(2)能利用农副产品及工业废水、废料。(3)繁殖力旺盛，杂菌污染困难，沉淀、过滤、分离油脂容易。(4)油脂风味良好，食用无害，易消化吸收。(5)用于工业化生产时能适应工业化深层培养，装置简单。此外菌种不同，培养条件不同，产品也不同。一些菌株油脂的脂肪酸组成、类型及甘三酯组成2）菌株的选择脂肪粒计数法、苏丹三菌泥染色法、碳饥饿检出法3）菌株的制备1微生物油脂的生产工艺流
