《维氏气单胞菌th0426株主要黏附素基因的克隆、生物信息学分析及原核表达》由会员分享，可在线阅读，更多相关《维氏气单胞菌th0426株主要黏附素基因的克隆、生物信息学分析及原核表达（9页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、维氏气单胞菌 TH0426 株主要黏附素基因的克隆、生物信息学分析及原核表达 许瑞 田佳鑫 张冬星 康元环 安鼎杰 单晓枫 钱爱东 吉林农业大学动物科学技术学院 摘 要： 为研究维氏气单胞菌 (Aeromonas veronii) 主要黏附素 Aha1 基因的生物信息学特性, 本试验克隆了 A.veronii TH0426 主要黏附素 Aha1 基因片段, 构建了Aha1 基因序列进化树, 通过生物信息学软件分析其编码蛋白的理化性质、疏水性、信号肽、跨膜区、二级结构及三级结构, 并进行了 Aha1 蛋白的原核表达及免疫原性的检测。结果显示:Aha1 基因全长 1 038bp, 编码 345 个
2、氨基酸。TH0426 株 Aha1 与 A.veronii 属同一分支, 具有信号肽, 跨膜区, 二级结构以 折叠、无规则卷曲为主。SDS-PAGE 及 Western blot 分析结果显示, Aha1 蛋白在大肠杆菌中成功表达且其能被鼠抗黏附素阳性血清识别, 表明 Aha1 蛋白具有一定的反应原性。以上结果为进一步研究 Aha1 蛋白的结构功能 Aha1 基因工程亚单位疫苗的制备奠定了基础。关键词： 维氏气单胞菌; 黏附素 Aha1 基因; 原核表达; 生物信息学分析; 作者简介：许瑞 (1992-) , 女, 硕士。作者简介：单晓枫 E-mail:;作者简介：钱爱东 E-mail:收稿日
3、期：2016-06-28基金：国家自然科学基金资助项目 (31201927) Cloning, bioinformatic analysis and prokaryotic expression of Aha1 gene of Aeromonas veronii TH0426 from yellow catfishXU Rui TIAN Jia-xin ZHANG Dong-xing KANG Yuan-huan AN Ding-jie SHAN Xiao-feng QIAN Ai-dong College of Animal Science and Technology, Jilin Agr
4、icultural University; Abstract： The Aha1 gene of A.veronii TH0426 was cloned by PCR and sequenced, then bioinformatic analysis was conducted to investigate the structure and function of the Aha1 gene.The physical and chemical properties, hydrophobicity, the signal peptide, transmembrane region, seco
5、ndary structure and tertiary structure of Aha1 that the gene encoded were analyzed and predicted by using bioinformatics software, then prokaryotic expression and immunogenicity analysis of recombinant protein were carried out.The results showed that the length of Aha1 gene was 1038 bp, encoding 490
6、 amino acid residues.The Aha1 gene was clustered into the same branch with A.veronii.The Aha1 contained the signal peptide and transmembrane region.Secondary structure of Aha1 was mainly-fold and random coil.SDS-PAGE and Western blot analysis show that Aha1 gene was expressed in E.coli, which could
7、be recognized by anti-Aha1 mouse positive sera, indicating that the recombinant protein has a strong immunogenicity.It laid a foundation for further study of outer membrane protein genetic engineering vaccine.Keyword： Aeromonas veronii; adhesin Aha 1 gene; prokaryotic expression; bioinformatic analy
8、sis; Received： 2016-06-28维氏气单胞菌 (Aeromonas veronii) 属于气单胞菌科, 气单胞菌属, 是近年来新发现的条件致病菌1, 广泛分布于自然环境中, 尤其在水体、污泥中分布较多, 是许多养殖场鱼类死亡和流行性溃疡综合征的主要病原菌2;其也可引起人类的腹泻3-4、胃肠炎5、肺炎、脑膜炎甚至菌血症6, 是一种典型的人-兽-鱼共患病原菌。因此, 对维氏气单胞菌的研究具有重要的经济价值及公共卫生学意义。研究发现, 维氏气单胞菌的致病性与其产生多种毒力因子密切相关, 如外膜蛋白、气溶素、肠毒素等7, 其中外膜蛋白在促进黏附宿主细胞的致病机制中发挥重要的作用, 其
9、可促进致病菌对宿主营养的摄取及抵抗机体免疫防御8。大分子黏附蛋白通常可介导细菌黏附于宿主表面, 其中黏附素是菌体表面的小分子, 其具有与细胞基质表面的受体特异性结合的能力。ATKINSON等9报道了人源嗜水气单胞菌黏附素的特性, 结果表明存在大小约 43 000 外膜蛋白;有研究表明, 嗜水气单胞菌的黏附素可能是一种保守性抗原10, 其能诱导不同血清型的嗜水气单胞菌产生交叉免疫反应应答11。此外, 由于外膜蛋白是导致细菌感染的重要因子且位于菌体表面, 其可作为一种有效的疫苗候选者。本试验以鱼源维氏气单胞菌 TH0426 株为研究对象, 通过 PCR 扩增 Aha1 基因, 在此基础上对其进行生
10、物信息学分析, 为 Aha1 在原核中的高效表达提供参考, 同时为进一步制备维氏气单胞菌基因工程亚单位疫苗奠定理论基础。1 材料与方法1.1 菌株及试验动物黄颡鱼源 A.veronii TH0426 菌株;大肠杆菌感受态 DH5、BL21 (DE3) 由本实验室保存;6 周龄 BALB/c 小鼠体质量 1822g/只, 由吉林省实验动物中心提供。1.2 主要试剂限制性内切酶 BamH、Sac、T 4DNA 连接酶、克隆载体 pMD18-T、表达载体pET-30a (+) 及 BCA 蛋白定量试剂盒购自均购自宝生物工程 (大连) 有限公司;广谱蛋白 Marker、预染彩虹蛋白 Marker 购自
11、北京全式金公司;DNA 凝胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒、细菌基因组提取试剂盒购自天根生化科技 (北京) 有限公司;HisPur Ni-NTA Spin Columns 购自 Thermo 公司;气单胞菌鉴别培养基 Rimler-Shotts 琼脂培养基 (RS 琼脂) 购自北京路桥技术有限责任公司;1.3 引物的设计与合成根据 GenBank 登录的维氏气单胞菌 TH0426 全基因组 (CP012504.1) 12, 利用Primer 5.0 软件设计 1 对特异性引物, 上游引物P1:TAGGATCCATGAAAAAGACAATTCTG-GCTAT (下划线处为 BamH酶切位点) ,
12、 下游引物 P2:ATGAGCTCTTAGAAGTTGTACTG-CAGAGCAAC (下划线处为 Sac酶切位点) , 引物由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成。1.4 Aha1 基因的扩增将黄颡鱼 A.veronii TH0426 菌液在 RS 平板上划线, 30培养 24h。挑取单菌落接种于 LB 培养基中, 培养 24h, 参照试剂盒说明书提取基因组 DNA, 并以其为模板, 进行 PCR 扩增, 反应条件为:945 min;941 min、521min、721 min, 30 个循环;7210 min。PCR 扩增产物用 1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。1.5 目的基因的序列分析及
13、系统进化树构建将测序结果应用 BLAST 检索系统 (http:www.ncbi.nlm1nih.gov/Blast.cgi/) 进行序列同源性分析, 与已知维氏气单胞菌的 Aha1 基因序列进行比对, 并采用邻接法 (Neighbour-joining) 构建系统发育树, 通过 1 000 次自举分析 (Boostrap) 进行置信度检测。1.6 目的基因编码产物的生物信息学分析运用 NCBI 的 ORFFinder, 采用 ExPASYProtParam tools 预测蛋白分子量;运用DNAStarProtean 软件预测疏水性;登陆 (http:/www.cbs.dtu.dk/serv
14、ices/SignalP/) 网站, 使用 SignalP4.0 对蛋白质序列的信号肽进行预测分析;通过 TMpred server2.0 (http:/www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/) 进行跨膜区的预测分析;运用SSPro4.0 和 SWISS-MODEL 预测蛋白二、三级结构。1.7 pMD18-T-Aha1 重组菌株的构建按照 DNA 凝胶回收试剂盒的说明书回收目的基因, 并与克隆载体 pMD18-T 连接, 构建重组质粒 pMD18-T-Aha1, 将重组质粒转化入大肠杆菌感受态 DH5 中, 挑取阳性克隆子提取质粒, 由生工生物工程 (上海) 股份有限公
15、司完成测序工作。1.8 表达载体的构建与鉴定将 pMD18-T-Aha1 和 pET-30a (+) 载体分别用 BamH和 Sac双酶切, 用 T4DNA连接酶 25连接 3h, 转化至大肠杆菌感受态 DH5, 提取重组质粒, 并转化至BL21 (DE3) 感受态细胞中, 构建 pET-30a (+) -Aha1 菌株;挑取阳性克隆子于含卡那霉素的 LB 液体培养基中, 37180r/min 培养 12h 后提取质粒。随后进行 PCR 鉴定和双酶切鉴定, 将阳性质粒送至生工生物工程 (上海) 公司进行测序。测序后的阳性质粒命名为 pET-30a (+) -Aha1。1.9 重组蛋白的诱导表达
16、将含有 pET-30a (+) -Aha1 的表达菌株以 1%接入新鲜 LB 液体培养基中, 37过夜培养至 D600=0.6, 加入终浓度为 100mmol/L 的 IPTG, 诱导 8h。同时以未诱导的菌液为对照, 超声波裂解 10min, 12 000r/min 离心 15min 弃去上清, 加入260L 生理盐水重悬, 煮沸 10min, 12 000r/min 离心 10 min 取上清, SDS-PAGE 分析 Aha1 蛋白表达情况。1.1 0 重组蛋白的纯化及浓度测定鉴于 Aha1 蛋白表达主要以包涵体形式存在, 因此, 将诱导后的菌液超声破碎后取沉淀, 洗涤包涵体。将溶解后的蛋白溶液进行 Ni 柱亲和层析纯化, 并将产物进行 SDS-PAGE 分析, 随后对纯化包涵体蛋白进行梯度复性。将收集的洗脱液装入透析袋中, 依次放置含 6, 4, 2, 0mol/L
