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1、第 1 页 共 23 页脓汁和粪便标本中病原菌的检测摘要脓汁和粪便标本中有不同的病原菌。为了探究两种标本中病原菌的种类、特性和生化反应等，本实验将对脓汁和粪便中的病原菌进行分离培养、革兰染色、生化反应、血清学反应、细菌药物敏感性试验等操作。在实践中学习培养基的制备、消毒和灭菌，细菌的分离与培养，细菌群体和个体形态特征的观察，细菌生化反应鉴定等操作方法。从而达到掌握各种微生物实验的操作方法，培养对微生物实验的兴趣，反思微生物实验中所遇到的问题并总结探讨如何解决优化的目的。引言 常见的化脓性病原菌有金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、脑膜炎球菌、肺炎链球菌、结核杆菌、淋病奈瑟菌、铜绿假单胞菌等。临床上，
2、脓汁标本在做细菌分离培养的同时，须直接涂片检查，观察是否有典型形态的菌体，芽孢有无，为临床提供最初的诊治依据；粪便和经离心的尿沉淀物等则直接接种与指定的培养基中。粪便标本中常见的病原菌有志贺氏菌属、大肠埃希菌属、弧菌属、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、艰难梭菌等。粪便标本中常含有很多杂菌，应根据检验目的菌的不同而选择培养基（如 SS 琼脂、伊红-美蓝平板等），选择培养基时应根据需要尽可能地抑制杂菌，以利于病原菌的检出。本实验通过常规的病原菌检测方法从脓汁标本中分离出黄白两种细菌，均为革兰氏阳性球菌，其中黄色是致病菌金黄色葡萄球菌，白色是白色葡萄球菌；从粪便标本中分离到紫黑色和粉红色的细菌，均为革兰氏
3、阴性杆菌，其中紫黑色的是大肠埃希菌，粉红色的是痢疾志贺菌。第 2 页 共 23 页1.实验材料1.1 器材 酒精灯、接种环、接种针、打火机、试管、棉塞、油性笔、污物盘、普通冰柜、奥林巴斯 CX21 型生物显微镜、拭镜纸、称量纸、药勺、牛皮纸、电炉、橡皮筋、锥形瓶、刻度尺、镊子、玻片、吸水纸、培养皿、高压蒸汽灭菌器、隔水式电热恒温培养箱等。1.2 试剂药品 脓汁标本、粪便标本、营养琼脂、营养肉汤、半固体琼脂、普通营养琼脂培养基、伊红-美蓝培养基、斜面琼脂、结晶紫、卢戈碘液、95%乙醇、稀释品红、香柏油、拭镜油、葡萄糖微量发酵管（2 支）、乳糖微量发酵管（2 支）、青霉素抗菌素纸片、先锋霉素抗菌素
4、纸片、庆大霉素抗菌素纸片、蒸馏水、生理盐水、兔血浆、福氏志贺菌诊断血清等。2.实验方法与步骤实验的总流程：培养基的制备细菌的分离培养细菌的纯培养细菌的形态学检查细菌的生化试验等细菌的血清学试验、结果分析2.1 培养基制备（1）营养琼脂培养基营养琼脂干粉与蒸馏水按适当比例充分混合均匀加热溶化高压蒸汽灭菌倒平板分装琼脂完全凝固后，平板倒放4冰箱保存备用（2）斜面培养基第 3 页 共 23 页营养琼脂干粉与蒸馏水按适当比例充分混合均匀加热溶化高压蒸汽灭菌倒试管分装培养基趁热斜放琼脂凝固以后，4冰箱保存备用2.2 空气与人体体表细菌学检查2.2.1 空气的细菌学检查2.2.1.1 实验方法自然沉降法:
5、根据空气中细菌气溶胶粒子，在地心引力的作用下，以垂直的自然方式沉降到培养基表面，培养以后，计数菌落形成单位（ Colony-Forming Units，CFU），可了解空气的污染情况。2.2.1.2 实验步骤每组 1 个营养琼脂平板，选择采样地点（实验室、卫生间、走廊等）将平板盖打开，盖朝下放置在平板旁边平板暴露于空气中 15 分钟平板倒扣盖上作标记37温箱培养 24 小时观察结果2.2.2 人体体表的细菌学检查2.2.2.1 实验步骤甲常规洗手，乙标准洗手，甲和乙共用 1 个平板。按下图在普通平板上接种手指上的细菌。第 1 格为洗手前，第 2 格为洗手后，第 3 格为消毒后，第 4格空白对照
6、。第 4 页 共 23 页2.3 细菌的分离培养2.3.1 实验方法平板划线法：借助于划线，将混杂的多种细菌，在平板表面分散成单个细菌，并固定在某一点上。培养以后细菌各自分裂繁殖，形成肉眼可见的细菌集团（单菌落）。2.3.2 实验步骤接种环烧灼灭菌分别取脓汁标本与粪便标本点在普通平板和伊红美蓝平板上，各做两份烧掉接种环上多余的脓汁或粪便标本冷却后，使用分区划线分离法，将脓汁标本接种于营养琼脂平板（2 份），粪便标本接种于伊红美蓝平板（2 份）接种环烧灼灭菌将平板倒置 37培养 1824h观察结果第 5 页 共 23 页2.4 细菌的群体生长特性观察和纯化培养2.4.1 实验方法斜面接种法：是一
7、种从已经生长好的菌种中挑取少量菌种移植到另一个斜面培养基的饭方法。该法主要用于单个菌落的纯培养、保存菌种或观察细菌的某些特性。用灭菌的接种环取单个菌落或少许细菌，从培养基斜面底部向上划一条直线，然后从底部向上作连续曲线划线，一直划到斜面顶端。2.4.2 实验步骤接种环烧灼灭菌挑选平板上典型的四种单菌落（白色、金黄色、紫黑色、粉红色）进行斜面接种纯培养做好标记接种环烧灼灭菌斜面培养基置于37培养过夜保存备用2.5 细菌的个体形态特征的观察2.5.1 实验方法:革兰氏染色法和肉汤接种法2.5.2 实验原理革兰氏染色法：G 菌的细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩
8、小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上，呈紫色。G菌的肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，稀释品红复染后呈红色。2.5.3 实验步骤革兰氏染色法：涂片 干燥 固定 染色 具体步骤如下：第 6 页 共 23 页取洁净玻片用灭菌操作后的接种环取生理盐水 1-2 环于玻片上挑取细菌培养物少许与盐水轻轻抹匀待涂片干燥后在酒精灯火焰外侧快速来回 2-3 回合 结晶紫 初染 1 分钟水洗卢戈碘液媒染 1 分钟水洗95乙醇脱色约 20 秒钟水洗稀释品红复染 1 分钟水洗吸干,镜检。2.5.4 肉汤接种法接种环烧灼灭菌分别在斜面培养物中
9、挑取菌苔少许立即移入肉汤培养基管中在接近液面的管壁上轻轻研磨沾取少量肉汤调和混匀试管口通过火焰 2-3 次灭菌塞好棉塞35培养 4-6 小时2.6 药敏试验2.6.1 实验方法纸片扩散法: 将含有定量抗菌素的纸片，平贴在已经接种了试验细菌的平板上。纸片中的抗菌素吸收培养基的水分，溶解后不断向周围扩散，形成递减的梯度浓度。敏感细菌在纸片周围的生长受到抑制，而形成没有细菌生长的抑菌圈。第 7 页 共 23 页2.6.2 实验步骤接种环烧灼灭菌分别取之前实验中得到的四种菌液在普通平板密集涂布接种环烧灼灭菌 标记:青、先、庆 镊子火焰消毒贴青霉素、先锋霉素、庆大霉素纸片 按压镊子消毒倒置 37培养 1
10、824 小时 观察结果2.7 血浆凝固酶试验2.7.1 实验方法：玻片法2.7.2 实验步骤取干净玻片一张在左右两边分别滴加兔血浆 15l，生理盐水 15l 滴接种环烧灼灭菌冷却分别用接种环取之前实验所得到的白色和黄色菌苔(23 个菌落的菌量)与血浆研磨混合边混匀边观察结果接种环烧灼灭菌稍等片刻，观察结果2.8 糖发酵试验接种针烧灼灭菌用灭菌接种针分别刮取实验所得到的紫黑色和粉红色菌苔分别接种在葡萄糖发酵微量管中和乳糖发酵微量管内接种环烧灼灭菌将微量管平放在平板内37培养过夜后观察结果2.9 动力试验2.9.1 实验方法：半固体接种法2.9.2 实验步骤接种针烧灼灭菌分别用接种针在紫黑色和粉红
11、色的斜面取菌从半固体培养基中心垂直刺入，可刺达近底管处，但不要到达管底循原来的路线退出接种针试管口迅速通过火焰 2-3 次灭菌塞好棉塞烧灼灭菌接种针37培养第 8 页 共 23 页24 小时观察结果2.10 血清学实验取洁净的玻片一张将磨面近端设为对照区滴加生理盐水 15ul远端设为试验区滴加福氏志贺菌诊断血清 15ul接种环烧灼灭菌用接种环分别取粉红色菌苔研磨于盐水或血清内，混合均匀接种环烧灼灭菌玻片来回倾侧观察结果3.结果3.1 空气的细菌学检查本小组将营养琼脂平板放置在女洗手间外的走廊上，暴露了 15 分钟，并在37温箱培养了 24 小时，所得结果：营养琼脂平板上一共出现 6 个菌落。经
12、与实验室其他小组的实验结果相比，发现：若以菌落数的多少表示空气细菌含量的多少，则秋实堂五栋内，空气细菌含量最少的为女洗手间，而窗台、实验室等处空气细菌含量最大。经老师的指导与小组间的讨论得出如下猜想：空气细菌含量与场所人流量、通风状况等都有着密切的关系。人流量大且密闭不通风的条件下空气细菌含量大。第 9 页 共 23 页3.2 人体体表的细菌学检查正常人的手作为人最常使用的部位之一，所接触到的细菌会比较多，其中有常驻菌群和暂驻菌群。皮肤“常驻菌群”种类、数量相对比较固定，清洗后数量可以减少，但不会彻底消失。皮肤“暂驻菌群”是由于人体频繁接触外部环境而沾染上的各种细菌。如上图所示，横轴上方为标准
13、洗手，横轴下方为常规洗手。结果显示：标准洗手后培养基上的细菌数目反而增多，且多于常规洗手所得的细菌数目。经老师指导和小组间讨论得如下猜想：在标准洗手的过程中如果搓手，那么会将原来隐藏在皮肤深处的细菌带到手的表面，这样的手在干燥后接触培养皿时，会留下更多细菌。3.3 细菌的分离培养第 10 页 共 23 页根据任务分配，本人是乙，所取标本为脓汁标本，所接种的培养基为营养琼脂培养基。37培养 1824h 后观察得上图结果。本次分区划线分离法操作成功，且得到了一定数目的单菌落，菌落颜色有黄色和白色两种。另有伊红美蓝培养基得到两种菌落，颜色有紫黑色和粉红色两种。根据具体结果制得下表：细菌分离培养结果表
14、标本 脓汁 粪便菌落颜色 金黄色 白色 紫黑色 粉红色形态特征 圆形、隆起、表面光滑、边缘整齐、不透明，菌落较小，直径为 2mm 左右具有金属光泽、大而隆起、不透明，菌落直径 23mm半透明，菌落较小，直径为12mm结果 根据形态特征可大胆推测为葡萄球菌；根据菌落颜色，金黄色的是金从形态上暂时不能鉴别是什么细菌，需要进一步检测鉴定第 11 页 共 23 页黄色葡萄球菌，白色的是白色葡萄球菌3.4 细菌的个体形态特征的观察四种细菌在 1000油镜下观察结果如上图，具体形态如下图：根据实验结果绘制下表：第 12 页 共 23 页细菌的个体形态特征表菌落来源 脓汁标本 粪便标本菌落颜色 黄色 白色
15、紫黑色 淡粉红色油镜下特征 呈紫色，均为 G+球菌，呈葡萄串状，排列不规则呈红色，均为 G-杆菌，散在排列3.5 糖发酵实验和动力试验结果第 13 页 共 23 页根据实验结果绘制下表：葡萄糖 乳糖 半固体紫黑色 +粉红色 - -：产气产酸 +：产酸不产气或阳性 -：不产酸不产气或阴性经查阅资料得肠道杆菌生化反应特性如下表：葡萄糖 乳糖 半固体埃希菌属 +第 14 页 共 23 页志贺菌属 - -沙门菌属 /+ - +霍乱弧菌 + - +变形杆菌属 - +：产气产酸 +：产酸不产气或阳性 -：不产酸不产气或阴性根据肠道杆菌生化反应特性表与实验结果对照得结果为：紫黑色菌落为埃希菌属，粉红色菌落为志贺菌属。3.6 血浆凝固酶实验结果实验结果如上图。放大观察如下图：第 15 页 共 23 页根据致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，可使血浆中的纤维蛋白原转变为不溶性纤维蛋白,附着于菌体表面,形成凝块的原理，可得结果：金黄色菌落为金黄色葡萄球菌，白色菌落为白色葡萄球菌。3.7 血清学实验实验结果如上图。放大观察如下图：菌液凝集者记为阳性，菌液均匀混浊记为阴性。根据上图得实验结果得：粉红色菌落为志贺菌属。3.8 药敏试验结果第 16 页 共 23 页根据实验结果绘制下表：
