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1、拟南芥蛋白激酶 CDPK11 融合蛋白的纯化及鉴定 袁敏 邢继红 王莉 张岚 葛伟娜 张家琦 华北理工大学生命科学学院基因组学与计算生物学研究中心 河北农业大学真菌毒素与植物分子病理学实验室 摘 要： CDPK11 是钙依赖蛋白激酶家族的重要成员, 为了获得纯化的 His-CDPK11 融合蛋白, 首先克隆了 1 488bp 的 CDPK11 全长基因, 酶切连接构建到 pGEX-4T-3 载体上, 获得 His-CDPK11 原核表达载体并转化大肠杆菌表达菌株 BL21;经 IPTG诱导和 His 镍柱体系纯化获得分子量为 50ku 的 His-CDPK11 融合蛋白;Western blo
2、t 免疫印迹技术检测证实该蛋白能被 Anti-His 抗体识别, 表明获得了正确融合的 His-CDPK11 蛋白, 为进一步解析 CDPK11 参与植物开花调控的分子机制提供了有力的工具.关键词： CDPK11; 原核表达; 融合蛋白; 免疫印迹; 作者简介：袁敏 (1982-) , 女, 河北卢龙人, 讲师, 博士, 研究方向为植物分子生物学.收稿日期：2017-07-02基金：国家自然科学基金 (31401212) Recombinant Purification and Identification of Protein Kinase CDPK11 of Arabidopsis tha
3、lianaYUAN Min XING Jihong WANG Li ZHANG Lan GE Weina ZHANG Jiaqi Center for Genomics and Computational Biology, College of Life Science, North China University of Science and Technology; Mycotoxin and Molecular Plant Pathology Laboratory, Agricultural University of Hebei; Abstract： CDPK11 is an impo
4、rtant member of Ca2+ dependent kinases.In order to obtain His-CDPK11 recombinant protein, the full length of 1 488 bp CDPK11 gene was cloned, digested and constructed into pGEX-4 T-3 vector to obtain His-CDPK11 prokaryotic expression construct.The recombinant His-CDPK11 plasmid was transformed into
5、Escherichia coli strain BL21.The 50 ku recombinant His-CDPK11 protein was expressed induction with IPTG and purified by Ni-NTA affinity column.The purified protein could be detected by Anti-His antibody in western blot assay, indicating that the purified protein was correct recombinant His-CDPK11 pr
6、otein.This would provide a powerful tool for further illustration of the molecular mechanism of CDPK11 mediated flowering in plants.Keyword： CDPK11; prokaryotic expression; recombinant protein; western blot; Received： 2017-07-02蛋白激酶是一种能够催化蛋白质发生磷酸化反应的酶, 能够转移 ATP 磷酸基团到底物蛋白质的氨基酸残基上, 负责蛋白质的磷酸化修饰.植物中蛋白激酶
7、的种类很多, 根据其底物蛋白质被磷酸化的氨基酸残基的种类, 可以分为丝氨酸/苏氨酸 (Ser/Thr) 蛋白激酶、色氨酸蛋白激酶、酪氨酸 (Tyr) 蛋白激酶、组氨酸蛋白激酶以及天冬氨酰/谷氨酰蛋白激酶这 5 类1-4.钙依赖蛋白激酶 (CDPKs) 是植物中的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶, 与植物细胞中 Ca 的信号传递密切相关.植物中 CDPKs 家族成员很多, 目前在水稻和拟南芥中分别发现 31, 34 个编码 CDPKs 蛋白激酶的基因.尽管数量众多, 但是这些植物 CDPKs 结构比较保守, 都包括 4 个典型的结构域, 分别为可变区、催化区 (激酶结构域) 、自抑区和调节区.CDPK
8、s 蛋白激酶广泛参与植物的生长发育、抗逆反应、激素信号转导等重要的生理活动5-8.水稻中, OsCDPKs 基因参与调节水稻的抗寒、耐盐和抗旱响应9-10.玉米中, ZmCD-PK11 基因参与调节组织器官的伤害应答响应11-12.烟草中, NtCDPK4 基因的表达水平受赤霉素或盐处理的诱导13.拟南芥中, AtCDPK23 基因参与干旱条件下脱落酸 (ABA) 和Ca 对气孔的调节14.AtCDPK32 通过磷酸化转录因子 ABF 正向调节 ABA 信号转导15.AtCDPK28 跟植物维管组织发育有关16.笔者前期研究结果表明, 拟南芥 CDPKs 家族成员 AtCDPK11 可能参与植
9、物开花方面的调控.为进一步明确 AtCDPK11 参与开花调控的功能及其调控机制, 首先需要获得纯化的 CDPK11 融合蛋白, 但是目前未见 CDPK11 融合蛋白纯化方面的相关报道.原核表达技术是一种简便易行的获得异源融合蛋白的方法.实验室常用的融合标签有 His, Flag, GST 和 MBP 等.选取标签首先要考虑标签是否会影响蛋白质的表达、正确折叠以及稳定性, 其次还需考虑带有该标签蛋白的纯化成本、纯化流程的复杂程度等17.本文中, 笔者利用原核表达技术, 选用最简便易行的 His 标签纯化了 His-CDPK11 融合蛋白, 并且获得的蛋白能够被 His 抗体特异识别, 表明成功
10、获得了正确融合的 His-CDPK 蛋白, 为后续 CDPK11 蛋白功能的研究奠定了基础.1 材料和方法1.1 试验材料大肠杆菌菌株 DH5, BL21 和 pET-28a 载体由本室保存;BamH和 Nde限制性内切酶、DNA 连接酶、PCR 扩增试剂均购于大连宝生物公司;His 纯化镍柱购于GE 公司.1.2 试验方法1.2.1 克隆 CDPK11 基因及构建 His-CDPK11 表达载体从拟南芥幼嫩叶片提取总 RNA, 反转录获得 cDNA 作为扩增模板, 利用 CDPK11基因特异性引物扩增获得 CDPK11 全长基因.将扩增产物经 BamH和 Nde酶切连入 pET-28a 载体
11、, 转化大肠杆菌 DH5.挑取克隆利用载体上游引物和基因上游 300bp 处反向引物进行菌落 PCR 鉴定, 选取克隆测序, 获得正确的 His-CDPK11 表达载体.1.2.2 纯化 His-CDPK11 蛋白His-CDPK11 蛋白用 Ni Sepharose 进行纯化.室温, 0.5mmol/L IPTG 过夜诱导菌体, 离心, 弃去上清.沉淀用 50mmol/L Tris-HCl (pH 7.4) 、150mmol/L NaCl、50mmol/L 咪唑样品缓冲液重悬, 为防止蛋白降解需加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂.超声破碎菌体, 离心, 收集上清液.将收集的上清液倒入 50mL
12、离心管中与 His 纯化基质 Ni Sepharose 混合, 加入 2mL/L 的 Triton-X100, 低速低温混匀 12h.离心去上清, 保留基质.用含 1mL/L Triton-X100 的样品缓冲液洗涤纯化基质 2 次.用蛋白洗脱缓冲液洗脱目的蛋白, 所用洗脱液为含有500mmol/L 咪唑、pH 7.4 的 Tris-HCl.最后利用浓缩管离心浓缩蛋白.1.2.3 Western blot 免疫印迹鉴定 His-CDPK11 蛋白为了验证获得的蛋白是否为 CDPK11 蛋白, 利用 Anti-His 抗体经过 Western blot 免疫印迹来检测.将 His-CDPK11
13、蛋白与其他阴性对照蛋白一起进行 SDS-PAGE 电泳, 转 PVDF 膜、奶粉封闭、依次孵育 AntiHis 一抗和 HRP 标记的二抗之后, 经化学发光系统检测条带18.2 结果与分析2.1 克隆 CDPK11 基因及构建 His-CDPK11 表达载体以 cDNA 作为模板, 利用 CDPK11 基因特异性的上下游引物 PCR 扩增获得全长CDPK11.利用 Nde和 BamH酶切将扩增片段连入 pET-28a 载体 (见图 1) , 经过菌落 PCR 及测序鉴定得到正确的表达载体 His-CDPK11 (见图 2) .2.2 His-CDPK11 融合蛋白的纯化与透析将转化 His-C
14、DPK11 载体的大肠杆菌表达菌株经 IPTG 诱导, 收集并超声破碎菌体, 离心后取上清使用 Ni-NTA 镍柱进行蛋白纯化.为了避免蛋白质溶液中的咪唑对后续蛋白试验造成影响, 纯化后 His-CD-PK11 蛋白透析 3 次去除咪唑.将所获得的蛋白进行 SDS-PAGE 和考马斯亮蓝染色分析, 结果发现, 获得了质量较好的 His-CDPK11 融合蛋白, 分子量大约为 50ku, 与预期大小一致 (见图 3) .图 1 CDPK11 基因的克隆 下载原图A.pET-28a 载体图谱;B.CDPK11 基因的扩增.图 2 His-CDPK11 载体的菌落 PCR 鉴定结果 下载原图M.DN
15、A 分子量标准;18.不同的 His-CDPK11 菌落.2.3 Western blot 免疫印迹鉴定纯化的蛋白利用 Western blot 免疫印迹技术, 检测试验所获得的蛋白是否能被 Anti-His的抗体识别, 进而鉴定纯化获得的蛋白是否为 His-CDPK11 融合蛋白.试验中利用不能被 Anti-His 抗体识别的 GST 标签蛋白 GST-FD 作为阴性对照.结果发现, Anti-His 抗体不能识别 GST-FD, 与阴性对照相比, Anti-His 抗体能够识别His-CDPK11 蛋白 (见图 4) .表明本研究中纯化获得的蛋白是正确融合的 His-CDPK11 蛋白.图
16、 3 His-CDPK11 蛋白的纯化 下载原图M.蛋白分子量标准;1.His-CDPK11.图 4 纯化的 His-CDPK11 融合蛋白能被 Anti-His 抗体识别 下载原图1.His-CDPK11+GST-FD;M.蛋白分子量标准;CBB.考马斯亮蓝染色.3 讨论蛋白质在生物体生命活动中必不可少, 蛋白翻译后修饰在生物体信息传递中发挥重要作用, 常见的蛋白质翻译后修饰有甲基化、乙酰化、糖基化和磷酸化等.蛋白磷酸化修饰是一种非常常见的蛋白翻译后修饰, 由蛋白激酶催化1.目前, 在生物体中发现了种类众多的蛋白激酶, 几乎参与调节所有的生物体生命过程.钙依赖蛋白激酶 CDPKs 是一类重要的依赖 Ca 的蛋白激酶, 目前, 植物中的多个CDPKs 基因已经被克隆出来, 参与调控多种信号转导途径7.但是目前还不能完全了解它们是否参与植物开花调控.因此, 关于 CDPK 是否参与开花途径方面的研究具有十分重要的意义, 而获得其融合蛋白又是其中的一个先决条件.
