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1、化学发光免疫分析技术在微生物检测中的应用 李静雯 刘清珺 杜美红 赵瑞雪 万宇平 吴小胜 冯月君 北京市理化分析测试中心北京市食品安全分析测试工程技术研究中心 北京勤邦生物技术有限公司北京市食品安全免疫快速检测工程技术研究中心 摘 要： 化学发光免疫分析技术凭借其化学发光的高灵敏性和免疫反应的高特异性在微生物快速检测中广泛应用。该文着重叙述了化学发光免疫分析技术核心检测体系在微生物检测中的研究进展, 并对其涉及到的样品前处理和检测新方法进行了综述。化学发光免疫分析技术检测微生物用时短、成本低, 但特异性识别方法和检测的灵敏度有待提升, 新型的发光体系、发光放大方法、可替代抗体的识别分子以及相关
2、的前处理技术是未来研究的重点。关键词： 化学发光免疫分析技术; 微生物检测; 前处理; 发光放大; 识别分子; 作者简介：杜美红, 博士, 副研究员, 研究方向:食品安全微生物快速检测, Tel:010-58717271, E-mail:dumeihongbeijin-收稿日期：2017-05-12基金：国家重大科学仪器设备开发专项 (2013YQ140371) Application of Chemiluminescence Immunoassay in Microbiological DetectionLI Jing-wen LIU Qing-jun DU Mei-hong ZHAO Ru
3、i-xue WAN Yu-ping WU Xiao-sheng FENG Yue-jun Beijing Engineering Research Center of Food Safety Analysis, Beijing Center for Physical and Chemical Analysis; Beijing Engineering Research Centre of Food Safety Immune Rapid Detection, Beijing Kwinbon Biotechnology Co., Ltd.; Abstract： Chemiluminescence
4、 immunoassay is widely used in the rapid detection of microbes because of its high sensitivity of chemiluminescence and high specificity of immune response. In the paper, the advance of the coresystems of chemiluminescence immunoassay in microbiological detection is emphatically illustrated. The rel
5、ated sample pretreatments and the new detection methods are reviewed.Although Chemiluminescence immunoassay in the microbiological detection has the advantages of rapidness and low consumption, its specific recognition and sensitivity could be further improved. The innovative luminescence systems, t
6、he luminescence amplification methods, the alternative recognition elements and the related pretreatment techniques are the focuses in future research.Keyword： chemiluminescence immunoassay; microbiological detection; pretreatment; luminescence amplification; recognition element; Received： 2017-05-1
7、2微生物检测是食品安全、临床诊断、环境监控、生物分析等领域的常见和必检项目, 全球的微生物检测市场每年约有 10 亿检测量1。致病微生物的快速准确检测对及时发现并合理控制污染和防止疾病的进一步传播至关重要。因此, 研发灵敏、快捷、成本低的微生物检测新技术具有重要的现实意义和广阔的应用前景。目前微生物检测采用国标方法, 即平板培养法。该方法需经过前增菌、选择性增菌、分离培养、生化鉴定等步骤, 虽然结果较为准确, 成本较低, 但检测过程繁琐, 一般需 46 d 的时间, 不适用于致病微生物的快速筛查与污染控制。近年来, 分子生物学和免疫学检测技术的蓬勃发展, 使得微生物的快速检测方法不断创新。分子
8、生物学检测技术, 如聚合酶链式反应 (Polymerase chain reaction, PCR) 2、实时荧光定量 PCR (Real-time quantitative PCR, q PCR) 3-4、环介导等温扩增 (Loop-mediated isothermal amplification, LAMP) 5-6生物芯片7-9, 以及免疫分析技术, 如酶联免疫吸附测定 (Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) 10-11、化学发光免疫分析技术 (Chemiluminescence immunoassay, CLIA) 12-13、侧流免疫层
9、析技术 (Lateral flow immunoassay, LFI) 14-15、电化学免疫分析技术 (Electrochemical immunosensor, ECIS) 16等均被应用于食品、环境样品的微生物快速检测, 检出限达到 10010CFU/m L, 检测时间为 0.55 h (表 1) 。这些快速检测技术在缩短微生物检测时间和降低检出限等方面表现出巨大的优势。分子生物学技术以检测微生物的核酸 (DNA 和 RNA) 为特点, 其灵敏度高、特异性好, 但较难区别死、活菌, 对检测体系、检测环境要求严格, 检测人员需要有较高的专业背景, 而且检测仪器昂贵, 限制了其在基层部门微生
10、物快速检测中的应用。免疫学检测技术以抗体特异性识别微生物细胞表面的抗原决定簇, 成本低廉、特异性好, 但是其检测用抗体较难制备和保存, 目前并不能对所有目标菌进行检测, 涉及的关键问题还需深入研究。化学发光免疫分析技术是近年来免疫分析技术中的研究热点, 该技术已成为真菌毒素、药物、激素、肿瘤标志物等物质的重要检测方法, 并开发出多种检测试剂盒17。化学发光免疫分析技术以其检测用时短、灵敏度高、设备兼容性强的特点在微生物检测中崭露头角, 本文针对化学发光免疫分析技术在食品、环境等领域中微生物检测的研究进展及应用进行阐述。表 1 常见的微生物快速检测技术 Table 1 Common rapid
11、detection techniques of microbes 下载原表 1 化学发光免疫分析技术检测微生物的原理1.1 检测原理1977 年 Halmann 等18首先建立化学发光免疫分析技术, 以参与化学发光反应的试剂 (发光剂或催化剂) 标记抗体, 标记后的抗体与待测物经过抗原抗体反应和分离步骤, 以化学发光的形式来定量反映待测物的含量。因为化学发光强度与化学发光反应速率相关, 而反应速率由标记物的含量决定, 所以化学发光强度可以作为定量依据17。相对于酶联免疫以颜色深浅定量、放射免疫以放射强度定量, 化学发光检测具有灵敏度高、可检测范围大、检测结果稳定和不易被干扰等突出优势。化学发光
12、免疫分析包括免疫反应系统和化学发光分析系统。免疫反应系统保证了检测的准确性和特异性, 化学发光分析系统决定了检测的灵敏度。1.2 免疫分析方法化学发光免疫分析技术是一种利用抗原和抗体的特异性结合来选择性识别和测定待测物的免疫分析方法, 一般分为竞争法和双抗夹心法。夹心法常用于大分子抗原的定量分析, 微生物检测多采用此法19:用免疫磁珠或包被了抗体的微孔板捕获目标菌, 加入标记抗体, 形成夹心复合物;将游离标记抗体分离, 再加入化学发光反应试剂, 测定发光强度, 目标菌浓度与发光强度成正比 (图 1) 。竞争法检测微生物, 将微生物的抗原决定簇包被在固相载体上, 与目标菌竞争结合标记抗体, 然后
13、测定固相载体上标记物的含量, 发光强度与目标菌浓度成反比 (图 2) 。由于夹心法涉及两种抗体, 检测的特异性优于竞争法, 测定结果更为准确。Gehring 等20以特异性识别大肠杆菌 O157H7 的 O 抗原和 H抗原的两种抗体作为夹心双抗, 避免了其他大肠杆菌种属的干扰, 降低了检测的假阳性率。Li 等21通过电化学发光免疫分析技术采用竞争法和夹心法检测大肠杆菌 O157H7, 并进行比较, 发现夹心法的检出限较低 (1.210CFU/m L) 且线性范围更宽。图 1 化学发光免疫分析技术检测微生物的双抗夹心法原理12Fig.1 Principle of sandwich immunoa
14、ssay format in microbiological detection by chemiluminescence immunoassay 下载原图图 2 化学发光免疫分析技术检测微生物的竞争法原理13Fig.2 Principle of competitive immunoassay format in microbiological detection by chemiluminescence immunoassay 下载原图1.3 化学发光体系以标记物区分, 化学发光体系一般分为 3 类:酶促化学发光、非酶促化学发光和电化学发光。酶促化学发光体系以催化剂为标记物, 灵敏度和稳定性
15、均优于以发光剂为标记物, 所以微生物检测一般采用酶促化学发光体系。标记物多采用辣根过氧化物酶 (Horseradish peroxidase, HRP) 13,19-20,22-25和碱性磷酸酶 (Alkaline phosphatase, ALP) 12,26。Liu 等22以 HRP 为标记物, 催化鲁米诺与 H2O2进行化学发光反应, 最强发光波长为 425 nm, 用双抗夹心法对牛肉中的大肠杆菌 O157H7 进行检测, 检出限为 5.510CFU/m L, 线性范围为 1010CFU/m L。Gehring 等26以 ALP 为标记物, 二氧化吖啶二钠盐 (APS-5) 为发光底物,
16、 同样利用双抗夹心法对牛肉中的大肠杆菌 O157H7 进行检测, 检出限为 7.610CFU/m L。APS-5 的稳定性较差, 显色温度需低于 20, 保存温度需低于-20, 限制了其广泛使用。目前, 常用的 ALP 催化的化学发光底物为二氧杂环乙烷类物质, 其中二氧环乙烷二钠盐 (AMPPD) 的应用最为成功12, 其在 ALP 催化下发生分解反应, 脱去磷酸基团, 产生 477 nm 的持续稳定的化学发光。AMPPD 性质十分稳定, 在无酶催化下水解速率非常慢, 极具应用潜力。以酶为标记物的化学发光是化学发光免疫分析的主流, 所占比例约为80%17。非酶促发光体系一般以化学发光试剂为标记物, 如鲁米诺、异鲁米诺、吖啶酯, 在过渡金属离子、过氧化物酶等催化剂的作用下与 H2O2反应, 目前关于微生物检测的报道较少。电化学发光是一类特殊的化学发光反应体系, 一般以联吡啶钌Ru (bp
