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1、Oenococcus oeni苹果酸乳酸酶基因克隆及其在酿酒酵母中的表达*中国生物工程杂志 China Biotechnology, 2005, 25(12):5055刘延琳 1蒋思欣 2何秀萍 2李华 1张博润 2*（1 西北农林科技大学葡萄酒学院杨凌 7121002 中国科学院微生物研究所北京 100080）摘要苹果酸乳酸酶是苹果酸乳酸发酵过程中负责苹果酸转化为乳酸的功能酶。在进行酒酒球菌 SD2a 的苹果酸乳酸酶基因(mleA)克隆测序基础上, 以 PGK1强启动子和 ADH1终止子为调控元件，以大肠杆菌酵母菌穿梭质粒 YEp352为载体，构建了重组表达质粒并转化酿酒酵母 YS58。酵母
2、转化子用 SD/Ura 平板筛选鉴定。斑点杂交检测表明目的基因mleA转化到受体菌中, SDSPAGE 检测表明获得的转化子表达了约 60kDa的目标蛋白。获得的转化子在添加了 L 苹果酸的培养基中培养 4d；取培养液上清用 HPLC检测 L 苹果酸及 L 乳酸含量，采用 t检验进行差异显著性分析，结果表明 mleA基因进行了功能性的表达，将 L 苹果酸转化成 L 乳酸，L 苹果酸和 L 乳酸含量分别与对照差异极显著和显著，苹果酸的相对降低率平均为 20.95%。 在有选择压力条件下，重组质粒相对稳定，而在无选择压力条件下，传代培养 10d后大约有 65%的重组质粒丢失。关键词酒酒球菌苹果酸乳
3、酸酶基因转化表达收稿日期：20050802 修回日期：20050909*陕西省自然科学基金及西北农林科技大学青年学术骨干支持计划资助项目* 通讯作者，电子信箱： 葡萄酒的酿造包含酒精发酵和苹果酸乳酸发酵（malolactic fermentation, MLF）两个生化过程,分别由酵母菌和乳酸菌在不同条件下完成。由于葡萄酒乳酸菌是在高酒精含量、低 pH值及存在有 SO2的环境中生长繁殖，MLF的过程往往比较缓慢，常出现迟滞现象，甚至引发微生物病害13 。如果能把乳酸菌参与 MLF过程的基因通过遗传转化导入酵母菌中，使酒精发酵和 MLF由重组酵母单独完成，则可减少细菌引发的葡萄酒酸败，避免乳酸菌
4、在 MLF过程中产生不必要的代谢副产物，缩短葡萄酒的酿造周期。苹果酸乳酸酶（malolactic enzyme, MLE）是 MLF过程中降解苹果酸的功能酶1,3 。不同来源的苹果酸乳酸酶基因在酿酒酵母表达研究311取得了一些进展。酒酒球菌（Oenococcus oeni）是优良的葡萄酒乳酸菌，关于 O. oeni苹果酸乳酸酶基因（mleA）的克隆及转换酿酒酵母的研究报道只有 1例3 ，且表达的效率较低。本研究进行我国自行筛选的优良酒酒球菌菌系 SD2a 的 mleA基因的重组表达质粒的构建及其在酿酒酵母中的转化和表达，进一步探索提高酿酒酵母重组菌株降酸效率的途径。1材料与方法 1.1材料1.
5、1.1菌株与质粒大肠杆菌 DH5、酿酒酵母 YS58（MAT,ura3，trp1，leu2，his4） 、质粒 YEp352（amp，URA3，YeastE.coli 穿梭载体） 、pVC7276 、pEA1 （YEp352：TADHI，何秀萍构建） 、pLmleA（YEp352：mleA，刘延琳构建） ，均由作者所在实验室保存。1.1.2工具酶、抗生素及试剂 RNase购自华美生物工程公司； T4 DNA连接酶、限制性内切酶购自宝生物工程有限公司；Taq DNA聚合酶、氨苄青霉素购自北京鼎国生物技术发展中心。分析纯 L 苹果酸购自北京化学试剂公司，色谱纯 L 苹果酸和 L 乳酸均购自 Sig
6、ma公司。1.1.3培养基及培养条件 大肠杆菌 DH5 保存和培养用 LB培养基，加入氨苄青霉素、IPTG和 Xgal 的 LB培养基用于筛选重组转化子12 ，37静置或振荡培养；酿酒酵母完全培养基为 YEPD培养基，转化子用含有色氨酸、亮氨酸、组氨酸的 YNB选择培养基13进行筛选鉴定，28静置或振荡培养。1.1.4引物根据已发表的酒球菌 mleA基因的核苷酸序列3 ，设计相应的寡核苷酸引物P1/P2进行目的基因的 PCR鉴定。下划线处分别是引入的 EcoRI和 KpnI酶切位点。P1：5CGGAATTCATGACAGATCCAGTAAGTAT3;P2 ：5TAGGTACCACACTCTCA
7、ACACTCGTAAT3 ；以上引物均委托上海生工公司合成。2005, 25(12)刘延琳 等：Oenococcus oeni苹果酸乳酸酶基因克隆及其在酿酒酵母中的表达中国生物工程杂志 China Biotechnology Vol.25 No.12 20051.2方法1.2.1基因操作质粒抽提、酶切反应、DNA 片段回收、连接反应、细菌转化等操作均参照“分子克隆”第 3版12略加修改。1.2.2重组表达质粒的 PCR鉴定分别以重组表达质粒及其菌液为模板，用 Taq酶进行 PCR反应，验证重组表达质粒的正确性。反应条件：94/5min；94/ 40s，56/2min，72/3min，共 29次
8、循环；72/ 15min。琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR产物。1.2.3酵母转化及转化子筛选酵母转化采用醋酸锂转化法13 ，转化子用 SD/Ura （含有色氨酸、亮氨酸、组氨酸的 YNB）平板筛选。1.2.4酵母转化子鉴定参照文献13进行转化子的营养缺陷型鉴定。参照文献14,15进行转化子的交配型鉴定。参照文献12进行酵母转化子的 PCR鉴定。1.2.5DNA斑点杂交鉴定提取酵母转化子的基因组 DNA，参照文献12进行。1.2.6SDSPAGE 检测参照文献12进行。1.2.7酵母转化子的功能检测将转化子以相同的接种量接于添加了 6.5g/L L 苹果酸的YEPD培养基中，28振荡培养 5d，取上
9、清，用高效液相色谱（HPLC）检测 L 苹果酸和L 乳酸含量。1.2.8重组质粒的遗传稳定性检测参照文献14,15进行。2结果与讨论 2.1mleA基因重组表达质粒的构建前期研究对 O.oeni SD2a 的 mleA基因进行了克隆测序16,17 ，所得包含 mleA基因的重组质粒命名为 pLmleA。用 EcoRI和 KpnI双酶切的质粒 pLmleA，用低熔点琼脂糖回收目的基因片段，与来源于 pVC7276 的 PGK1启动子和来源于 pEA1 的 ADH1终止子连接，共同插入穿梭质粒 YEp352，构建了重组表达质粒 pYELmleA（图 1） 。图 1mleA基因重组质粒和重组表达质粒
10、的构建Fig.1Construction of the recombinant plasmid and recombinant expressing plasmid of mleA通过 Amp抗性筛选及 a互补（蓝白筛选）获得单菌落，进行质粒快速抽提、质粒碱提、酶切等验证，获得重组表达质粒 pYELmleA。以 pYELmleA的阳性克隆为模板，以 P1/P2为引物进行 PCR扩增，得到了约 1.6kb的特异性片段（图 2） ，与 mleA基因的大小相符。回收 PCR扩增片段，用 EcoRV进行酶切，得到约 0.4kb和 1.2kb的两个片段，用 PvuII酶切，得到约 0.6kb和 1.0k
11、b的两个片段（图 3） ，结果同目的基因的酶切位点相符17 ，证明插入的目的基因片段正确，pYELmleA 的构建正确。图 2重组表达质粒的菌落 PCR验证Fig. 2Verified of transformants by colony PCRM：DGL2000 Marker；16：Result of colony PCR图 3PCR扩建产物的酶切分析Fig.3Verified with restriction enzymedigestion of PCR productM:DGL2000 Marker;1:EcoRV;2.Pvu2.2酵母转化及转化子鉴定将重组表达质粒及空载体 YEp352
12、分别转化酿酒酵母 YS58，转化子用 SD/Ura 培养基平板上筛选。获得的重组转化子 YSA进行 PCR鉴定，得到了预期的目的基因片段（图略） 。获得的重组转化子进而进行交配型和营养缺陷型鉴定, 结果重组转化子与受体菌同是 交配型（表 1） 。由于重组转化子弥补了受体菌的尿嘧啶缺陷, 因而可在 SD/Ura 培养基平板上生长（表 1） 。表 1酵母转化子营养缺陷型和交配型鉴定Table 1Mating type and auxotrophic test of yeast transformants菌株Mating type testAuxotrophic testaSD/Ura YNB+Le
13、u+Trp+His受体菌 YS58+ 空载体转化子 YS352+重组表达质粒转化子 YSA+2.3酵母转化子的斑点杂交检测分别提取酵母转化子 YSA 和 YS352（CK）的质粒 DNA，以回收的 mleA基因为探针，进行斑点杂交检测。杂交结果（图 4）显示，标记的探针与 O.oeni SD2a 的总 DNA及重组转化子的质粒 DNA有明显的杂交信号，而与宿主菌 YS58及空载体转化子 DNA没有可见的杂交信号，说明得到的重组酵母转化子是阳性转化子。图 4点杂交结果Fig.4Results of dot bloting hybridization1：O.oeni SD2a tatal DNA；
14、2：YS58 plasmid DNA；35: YSA plasmid DNA；6: YS352 plasmid DNA2.4目的基因在酿酒酵母中表达的蛋白检测进行转化子的 SDSPAGE 检测（图 5） ，结果表明 YSA表达了约 60kDa的目标蛋白。2.5mleA基因在酿酒酵母中表达的功能检测对酵母转化子培养上清液进行 HPLC检测，采用 t检验进行 L 苹果酸含量及 L 乳酸含量与对照的差异显著性分析。重组表达质粒的转化子经过在添加了 L 苹果酸的培养基中培养 4d，培养液上清中 L 苹果酸的剩余含量比对照极显著降低（表 2） 。对照未检出乳酸的生成，而供试转化子的乳酸生成量平均为 10
15、64mg/L，二者差异显著。L 苹果酸的相对降低率平均为 2095% 。以上结果表明 mleA基因进行了功能性的表达，将培养基中的 L 苹果酸转化成 L 乳酸，使得培养液中的 L 苹果酸含量降低。2.6重组表达质粒的遗传稳定性问题对重组转化子的遗传稳定性进行了研究，将 YSA分别在有选择压力（SD/Ura ）及无选择压力（YEPD）的液体培养基中连续传代培养 10d，每天取样检测质粒的丢失情况，结果表明（图 6） ，在有选择压力条件下，质粒相对稳定，而在无选择压力条件下，传代培养 10d后丢失 65%左右的重组质粒。这可能是由于表达所用的载体是附加体类型所致。图 5酵母转化子的 SDAPAGE 检测Fig.5SDAPAGE yeast transformantsM: Protein marker; 1: YS352; 2: YSA表 2酵母转化子培养液中 L 苹果酸和 L 乳酸含量的检测分析Table 2Detection and analysis of Lmalate and Llactic contents in culture supernatant of yeast transformants菌株L 苹果酸(mg/L)L 乳酸(mg/L)苹果酸降低率（%）苹果酸相对降低率（）YSA14876110625.07
