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1、细胞培养操作及其注意事项,易红飞20121116,一 、准备工作,1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30-60分钟灭菌，以酒精擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后，才开始实验操作。2. 从冰箱拿出试剂（培养基，胰蛋白酶，PBS等），放在室温条件下，或37水浴。水浴箱中水应常换，从水浴箱中拿出东西要擦干，喷酒精。3. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如移液器和枪头盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以酒精擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在台面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。4. 操作人员应注意自身的安全，
2、须穿戴实验衣及手套后才进行实验。用酒精擦拭手套后才可进行操作。5. 实验服应该定期灭菌和更换。进出细胞间时，不要同时打开相邻两个房间的门。,二、贴壁细胞的换液及传代,1. 换液当培养基中有较多漂浮的死细胞或者培养基颜色变黄，而细胞密度未达到60%左右时，可只考虑换液而暂时不进行传代。吸弃原培养液或直接倒弃，加入新的培养液。注意：对于一些贴壁不牢固的细胞株（如Hela 细胞），加入新培养液时应把枪头贴于器皿壁上缓慢注加，或需要避免更换枪头时，可考虑滴加于器皿壁上，以免把已贴壁的细胞吹起。）,2. 传代当细胞密度达到70%-80%时，需要进行传代。吸弃或者倒弃原培养液。加入适量PBS以漂洗除去残余
3、的原培养液。加入适量的胰蛋白酶，混匀后放置培养箱37孵育1-3分钟。观察细胞消化情况。加入完全培养基以终止消化。按比例把细胞传到新的培养皿中。放置细胞培养箱中培养。,注意：判断细胞是否要传代的准则是不能让细胞生长密度大于80%。血清中有抑制胰蛋白酶的成分。加入的胰蛋白酶的量不能太多，只要稍微能覆盖细胞层面即可。若加入的胰蛋白酶较多，会伤害细胞且有可能反而降低消化效率。孵育时间不能过长，否者对细胞照成伤害。一般来说1-3分钟足够，尽量不要超过5分钟。 贴壁较牢固的细胞株（如4T1细胞株），需要孵育时间较长，而贴壁不牢固的细胞株（如Hela 细胞株），需要孵育时间较短。一般来说，细胞生长密度较大时
4、，需要孵育时间较长。不需要专门离心以去除胰蛋白酶，加入完全培养基即可。若需要去除胰蛋白酶，可离心弃上清以除去胰蛋白酶。根据细胞生长速度的不同选择不同的传代比例。尽量不要使用原培养皿，因为经胰蛋白酶处理后的培养皿表面涂层会发生变化，会在一定程度上影响细胞的性状。,三、细胞计数及存活率检测,计数池两侧各有一支持柱，将特制的专用盖玻片覆盖其上，形成高0.10mm的计数池。计数池划有长、宽各3.0mm的方格，分为9个大格，每个大格面积1.0mm2。容积为0.1mm3，其中，中央大方格用双线双成25个中方格，位于正中及四角5个中方格是红细胞计数区域，用单划线分为16个中方格。当遇到位于大格线上的细胞，一
5、般只计数大方格的上方和右方线上的细胞。计算公式 细胞数（4个角大方格区域内的细胞数之和/4)104稀释倍数细胞悬液总体积细胞计数板用后要清洗，切勿用硬物洗刷。,细胞存活率检测,原理：采用台盼蓝据染法区分死活细胞，正常健康细胞能够排斥台盼蓝，而丧失细胞膜完整性的细胞可以被台盼蓝染色研制而成。严格来说，台盼蓝检测的是细胞膜的完整性，通常认为细胞膜丧失完整性，即可认为细胞已经死亡。商品化的0.4%台盼蓝染液，或自行配制（台盼蓝用生理盐水溶解）直接向欲计数的细胞悬液中加入等体积的台盼蓝染液，轻轻混匀，染色3分钟，不宜超过10分钟。然后计数。细胞存活率=（细胞总数-蓝色细胞数）/细胞总数100%,四、细
6、胞冻存,1. 冷冻前检测细胞是否保有其特有性质。2. DMSO应为试剂级等级，无菌且无色。小体积分装，4避光保存，勿做多次解冻。10%浓度配制冻存液。3. 由于DMSO稀释时会放出大量热量，故不可将DMSO直接加入细胞液中，必须使用前先行配制完成。4. adherent tumor lines: 5-7 x 106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma 解冻后须较高之浓度，而HeLa 只需1-3 x 106 cells/ml。other suspensions: 5-10 x 106 cells/ml, human lymphocyte 须至少5 x 106cells/ml。5. 回收
7、动物细胞，其离心速率一般为300g(约1,000rpm），过高的转速，将照成细胞死亡。,五、细胞复苏,1. 37解冻时，注意水面不可超过冷冻管沿，否者易发生污染情况。冷冻管由液氮中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管爆裂。2. 除少数特别注明对DSMO敏感的细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，应直接放入新鲜培养基中，待隔天再置换新鲜培养基以除去DMSO即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴壁的问题。3. 解冻后应迅速放入培养基中培养，切勿在冻存管中放置太久。,六、操作完处理,1.试剂瓶瓶口喷酒精，用封口膜封住后，拿回冰箱应该放置的位置。2. 清理工作台面，并用酒精消毒。下拉门，开紫外照射一般30分钟。3. 垃圾袋封口，拿出高压蒸气灭菌（如果有感染试剂）。4. 关掉37水浴箱的电源，细胞培养箱CO2浓度恢复至5%后，关掉房间日光灯，离开时在相应房间脱掉实验服和拖鞋。,
