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1、肢体滑膜关节和关节软骨的起源与形态发生1.INTRODUCTION肢体的滑膜关节也就是肘关节，髋关节，或是指间关节是复杂而多样的器官。它们由相互吻合的覆有关节软骨的表面组成，受关节间韧带和关节旁韧带固定，通过一层增厚的周围滑膜囊和滑液内衬，与身体环境隔绝开来（Archer et al.,1999） 。关节软骨本身相当复杂，在组织学上和表型上都可以分成不同的区（Hunziker et al.,2007） 。表层区域含有拉长而扁平状的细胞，其方向与关节面平行，被很大一块胶原性基质合在一起，并分泌润滑素（lubricin） ，透明质酸，以及其它抗黏附性大分子物质，这些东西对无摩擦的关节运动至关重要（
2、Jay et al.,2001） 。位于中间区域的关节软骨细胞呈圆形，通常形成小竖排，产生并维持着重要的胞外成分特别是型胶原蛋白和蛋白聚糖这使其有关键的生物力学特点：弹性。底部区域的软骨细胞一般较大，在产生和维持基质方面也比较活跃，并且有关键的组织边界称为软骨线（tidemark）位于关节软骨及其下面的软骨下骨质之间（Broom and Poole, 1982） 。关节软骨的结构在所有滑膜关节中都是相似的，但每个关节的位置和功能决定了其关节软骨截然不同的构造。举例来说，在髋关节，近乎球形而呈凹面的髋臼软骨与近乎球形而呈凸面的股骨头形成关节。在膝关节，两个远端股骨髁突与相对较平的近端胫骨平台形成
3、关节，但不与腓骨直接接触。膝关节也含有唯一的纤维软骨结构，比如半月板和关节间韧带，髋部有位于中央的圆肌，而指间关节有额外的侧韧带。这些解剖学，组织学，以及生物力学特征的非一般变异已经了解得很清楚了，并且其在关节功能，维持，持续，运动，以及机械负荷耗散方面的多种重要作用也了解得很清楚了（Li et al.,2013a） 。与之相比，现在还不清楚的是关节是如何形成，并在胚胎生成和出生后早期产生如此千姿百态的结构，组织，以及生物力学特点的，每个关节都精于且适应于特定的解剖学位置和不同的功能（Archer et al.,2003; Pacifici et al.,2005; Pitsillides a
4、nd Ashhurst, 2008） 。目前为止，产生关节及其特定组织的祖细胞是什么？关节软骨是如何产生其分层结构的？关节的两个面是如何按一种相互吻合的“锁和钥匙”方式成型的？这些领域的进展将有着明显的基础研究价值，也可以有重大地生物力学应用，也许有一天能领导对先天性疾病比如髋关节发育不良，以及年龄相关性疾病比如骨质疏松症的治疗。本篇回顾对近些年在关节发育研究方面的重大进展做了一个概括性的描述。2.间区的起源和细胞谱系的追踪数十年前在哺乳动物及鸟类胚胎中的经典研究显示早期肢体中软骨性骨骼的形成是连续而不间断的，比如 Y 形原基相当于柱状成分（肱骨或股骨） ，两块孤柱成分（zeugopod，桡骨
5、- 尺骨，腓骨 -胫骨） ，而独体成分（autopod）发散形成指骨成分（Hinchliffe and Johnson, 1980; Hamrick, 2001） 。这些研究以及其它研究引领了这样一种认识，即关节形成中最明显的信号是在将来的两个关节位置上，紧密接触的无血管性间质组织层的形成，将相邻的软骨成分阻断，因此一开始将其命名为“间区” （Holder, 1977; Mitrovic, 1978） 。间区由扁平状细胞组成，细胞的方向与肢体的主轴垂直。通过缝隙连接形成紧密地交界，需要缺氧调控因子 Hif-1 来行使功能（Archer et al.,2003; Provot et al.,20
6、07） 。由于间区细胞出现的位置之前被软骨细胞所占据，这就引起了一个暗示，即间区细胞源自，并且是去分化软骨细胞的直接后代（Craig et al.,1987; Nalin et al.,1995） 。当 Holder 通过显微手术方法在早期鸡胚中卵内移除预期肘关节位置的间区，后期就没有肘关节形成。这些数据第一次揭示出间区对关节形成是必须的，但没有弄清楚间区仅仅是一个生理上的标示出关节位置的指示呢，还是有额外的，更直接的引导作用。利用初期间区细胞表达生长和分化因子 5（Gdf5; Storm and Kingsley. 1996）这一事实，我们和我们的合伙伙伴们做了遗传学细胞谱系追踪和示踪实验，
7、使用的是复合 Gdf5-Cre;ROSA R26R (LacZ)报导小鼠（ Rountree et al.,2004; Koyama et al.,2008） 。我们发现 LacZ 阳性间区细胞及其前体细胞在发育期阶段内产生了许多关节组织包括关节软骨，滑膜内衬，以及关节间韧带这些组织维持到成年期（Fig.1A-B） 。因此，这些数据显示间区细胞不是一过性的，它们积极参与关节组织的形成，并形成一个祖细胞群体，该群体有形成关节的能力。在另一项同时进行的研究中，Hyde 及其伙伴们在发育阶段的膝关节中做了类似的细胞谱系追踪与示踪实验，使用的是复合 matrillin 1-Cre:R26R 小鼠；基质
8、素1（ matrillin-1）一般是被除了关节软骨细胞以外的所有软骨细胞所表达（Hyde et al.,2007） 。他们发现在 E13.5 时，LacZ 阴性的新生关节软骨细胞出现在早期膝关节位置，而邻近的细长软骨细胞是 LacZ 阳性的，这种类型随时间而持续。在相关实验中，同样的研究团体用Col2a1-Cre:R26R 小鼠进行发育阶段膝关节的细胞追踪，并发现标志基因呈阳性的细胞最初出现在关节软骨，十字韧带，以及内侧半月板（Hyde et al.,2008） 。在 E14.5 时标志基因呈阴性的细胞出现在发育阶段的关节中（称为中间区细胞） ，并且在晚期阶段也出现于半月板的外侧部分。作者总
9、结称膝关节的发育涉及到的细胞，存在于那些有 Col2a1 表达史的原基中，而侵袭性的 Col2a1 阴性细胞是从周围产生的。同样的，我们研究的 Indian hedgehog-null（ Ihh-/-）小鼠胚胎，其肢体骨骼成分完全是软骨性的，并且缺乏关节（Fig.1E-F） ，而在年龄相符的对照组同窝幼仔中可以预见到该处会出现关节（Fig.1C-D; Koyama et al.,2007） 。利用复合 Ihh-/-; Gdf5-Cre:R26R 胚胎，我们发现突变体中预期关节处形成 LacZ 阳性细胞（Fig.1E ，箭头所示） ，但位于两侧并包围着未间断的关节位置（Fig.1F，箭头所示）
10、。这些标志物阳性细胞表达间区标志基因，包括 Gdf5 和 Erg（Fig.1J-L，箭头所示） ，在对照组同窝幼仔中，表型上相似的细胞按指定的类型出现在关节内（Fig.1C-D and G-I） 。我们认为这些数据提示预期的关节祖细胞已经出现，在 Ihh-null 突变体中有特定的位置，但未能穿透融合的关节位置。Mundlos 及其伙伴们研究了短肢突变小鼠的关节发育阶段缺陷，提示两侧细胞的补充与迁入（Niedermaier et al.,2005） 。近期的细胞谱系追踪实验使用的是 Sox9CreERT2;R26R 小鼠胚胎，在 E11.5 时接受他莫昔芬，在 E17.5 进行检验，提示表达
11、Sox9 的细胞是关节软骨和生长板软骨的前体细胞，也是韧带和肌腱的祖细胞（Soeda et al.,2010） 。在一项实验中，Zhang 等人使用内源性双皮质素（Dcx ）来驱动小鼠胚胎中 LacZ 或 eGFP 的表达，他们发现表达 Dcx 的细胞最初构成了肢体间质的绝大部分，但后期限制在间区细胞和关节软骨细胞中（Zhang et al.,2010） 。与上面用 Sox9 做的实验结果一致，他们总结称关节软骨细胞和生长板软骨细胞是起源自表达 Dcx的一般性间质前体细胞，然后这些细胞分成关节软骨细胞和生长板细胞。TGF受体（Tgfbr2 ）对于关节形成是至关重要的，特别是在独体关节的形成中（
12、Spagnoli et al.,2007） 。人们使用了新的报导小鼠，它含有 Tgfbr2- Gal-GFP-BAC 结构，同时表达 - 半乳糖苷酶（-Gal）和绿色荧光蛋白（GFP）作为标志基因，用于监测表达 Tgfbr2 的细胞在发育阶段肢体骨中随时间的时间空间分布（Li et al.,2013b） 。E13.5 时，Tgfbr2- Gal 阳性细胞首先出现在关节的背侧和腹侧区域，在间区的中间区域未发现。到 E16.5 及出生后时，阳性细胞可在滑膜内衬，半月板表面，韧带，以及 Ranvier 区观察到，BrdU 标记显示表达 Tgfbr2 的细胞也组成了细胞周期较长的干/祖细胞。作者得出一
13、个有趣的结论，即在间区发育过程中，表达 Tgfbr2 的细胞会充当祖细胞，这种祖细胞在特定的细胞龛内掌控着关节的发育。总而言之，上述研究带来了对肢体关节发育过程，以及间区细胞发生，命运，所起作用的更好理解。上述数据及所获的了解可以总结并合成为下面这个普遍的模型（Fig.2） ，而各个肢体关节不同的形态及功能可能与特殊的事件有关。沿着未被打断的，表达Sox9/Col2/Dcx 的软骨原基，可以识别并确定预期的关节点所在，而其上游形态生成机制与决定机制尚不清楚。很快，Gdf5 的表达会被激活，这就确定了最初的间区间质细胞群，同时伴有细胞的迁入，并维持 Dcx 的表达；位于间区背部和腹部两侧的细胞会
14、激活 Tgfbr2 的表达，而被原基包围的软骨细胞会开始表达基质素 1（Sox9/Col2 /Matn1 阳性细胞；Fig.2B ） 。Gdf5 阳性细胞与其相应的软骨原基相邻 有 Sox9/Col2 阳性表达史，但不表达基质素 1将会分化成关节软骨细胞，这可能涉及特定基因的活化，包括 Erg 和 PTHrP（Iwamoto et al.,2007；Chen et al.,2008；Fig.2C） 。造成韧带生成与其它关节特异性结构（例如半月板）形成的额外的分化过程与机制可能涉及到 Gdf5 和 Tgfbr2 阳性细胞和阴性细胞（Fig.2D ） 。表达 Tgfbr2 的细胞也会构成一种慢周期
15、的储备性祖细胞群，它可在关节的修复与再生中起作用。3.间区和关节形成的调控Gdf5 阳性细胞一开始的特点是间质，随后参与软骨和纤维软骨关节组织的发生。因此，它们必然存在某种机制，在特定的时间和发育阶段关节中某个位置控制着它们独特的表型和分化的能力（Pacific et al.,2005） 。实际上，关节消融和软骨融合最初是在一般性或条件性小鼠胚胎突变体中观察到的，这些突变体缺乏 Noggin，Wnt4/Wnt9a，Tgfbr2，或 -catenin，造成这种情况的原因似乎是预期关节位置上软骨生成细胞异位分化，过量分化，或是过早分化（Brunet et al.,1998; Spater et a
16、l.,2006; Spagnoli et al.,2007; Koyama et al.,2008） 。在缺乏 Tgf-活化酶 1（TAK1 ：Gunnell et al.,2010）或硫酸乙酰肝素合酶 Ext1（Mundy et al.,2011）的小鼠胚胎中观察到关节缺失和部分 /完全融合，也可得出同样的结论和解释。如上文所指出的那样，关节融合也发生在缺乏 Ihh 表达的小鼠胚胎的肥大前生长板软骨细胞中，该发现最初揭示的是间区的形成和关节的发育受骨干（shaft）和生长板发育的精密协同调控（St-Jacques et al.,1999） 。在缺乏主要软骨生成基因 Sox5 和 Sox6 的小鼠胚胎突变体中，观察到严重的间区，关节，以及生长板缺失，这再次证实了肢体骨骼生成的这种有趣的方面（Dy et al.,2010） 。对间区基因表达与表型的调控，不久前的一些重要研究提供了新的观点。Kan 及其同事们发现 Sox11 在早期肢体软骨生成前骨凝聚过程（ condensation）中广泛
