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1、解析蛋白酶活性测定 聚焦蛋白酶研究新进展1 定义1g 固体酶粉( 或 1mL 液体酶)，在一定温度和 PH 值条件下，1min 水解酪素产生 1ug 酪氨酸为一个酶活力单位，以(u/ mL)表示。2 福林法(第一法 )2、1 原理蛋白酶在一珲的温度与 PH 条件下，水解底物，产生含有酚基的氨基酸(如：酪氨酸、色氨酸等)，在碱性条件下，将福林试剂(Folin)还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光度法测定，计算其酶活力。2、2 试剂和溶液2、2、1 福林试剂的制备于 2000mL 磨口回流装置中加入钨酸钠(Na2Wo42H2O)100g、钼酸钠(Na2MoO42H2O)25g、水 700mL、85%磷酸
2、50mL、浓盐酸 100mL，水火沸腾回流 10h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂(Li2SO4)50g、水 50mL 和数滴浓溴水(99%)，再微沸 15min，以除去多余的溴(冷后人有绿色需再加溴水，再煮沸除去过量的溴) ，冷却，见水定溶至1000ml。混匀，过滤。制得的试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。使用溶液：一份福林试剂与二份水混合，摇匀。2、2、2 碳酸钠溶液 c(Na2CO3)=0.4mol/L称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g，用水溶解并定容至 1000 mL。2、2、3 三氯乙酸 c(CCl3COOH)=0.4mol/L称取三氯乙酸 65.4g，用水溶解并定容至 1
3、000 mL。2、2、4 氢氧化钠溶液 c(NaOH)=0.5mol/L按 GB601 配制。2、2、5 盐酸溶液 c(HCI)=1 mol/L 及 0.1 mol/L按 GB601 配制。2、2、6 缓冲溶液a、磷酸缓冲液 (PH=7.5)适用于中性蛋白酶称取磷酸氢二钠(Na2HPO412H2O)6.02g 和磷酸二氢钠(NaH2PO412H2O)0.5g ，加水溶解并定容至 1000mL。b、乳酸缓冲液(PH=3.0) 适用于酸性蛋白酶甲液 称取乳酸(80%90%)10.6g，加水溶解并定容至 1000 mL。乙液 称取乳酸钠(70%)16g，加水溶解并定容至 1000 mL。使用溶液 取
4、甲液 8 mL，加乙液 1 mL，混匀，稀释一倍，即成 0.05moi/L 乳酸缓冲溶液。c、硼酸缓冲溶液(PH=10.5)适用于碱性蛋白酶甲液 称取硼酸钠(硼砂)19.08g ，加水溶解并定容至 1000 mL。乙液 称取氢氧化钠 4.0g，加水溶解并定容至 1000 mL。使用溶液 取甲液 500 mL、乙液 400 mL 混匀，用水稀释至 1000mL。上述各种缓冲溶液，均须用 PH 计校正。2、2、7 10g/L 酪素 3)溶液称取酪素 1.000g，精确至 0.001g，用少量 0.5mol/L 氢氧化钠溶液( 若酸性蛋白酶则用浓乳酸 23 滴) 湿润后，加入适量的各种适宜 PH 的
5、缓冲溶液约 80 mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直到完全溶解，冷却后，转入 100 mL 容量瓶中，用适宜的 PH 缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。注：3)酪素采用上海化学试剂采购供应站经销的试剂。2、2.8 100ug/mL L-酪氨酸 4)标准溶液a、称取预先于 105干燥至恒重的 L-酪氨酸 0.1000g，精确至 0.0002g，用 1mol/L 盐酸60 mL 溶解后定容至 100 mL，即为 1mg/ mL 酪氨酸标准溶液。注：4)L-酪氨酸采用上海长江生化制药厂产品。b、吸取 1mg/ mL 酪氨酸标准溶液 10.00 mL，用 0.1mol/L 盐酸定容至
6、 100 mL，即得到100ug/ mL L-酪氨酸标准溶液。2、3 仪器和设备2、3、1 恒温水浴 400.2。2、3、2 分光光度计 应符合 GB9721 的规定。2、4 分析步骤4、1 标准曲线的绘制a、L-酪氨酸标准溶液按表 3 配制表 3管 号酪氨酸标准溶液的浓度ug/ mL取 100ug/ mL 酪氨酸标准溶液的体积mL取水的体积mL0 0 0 101 10 1 92 20 2 83 30 3 74 40 4 65 50 5 5b、分别取上述溶液各 1.00 mL(须做平等试验)，各加 0.4mol/L 碳酸钠溶液 5.00 mL、福林试剂使用溶液 1.00 mL，置于 400.2
7、水浴中显色 20min，取出，用分光光度计于波长680nm，10mm 比色皿，以不含酪氨酸的 0 管为空白，分别测定其吸光度。以吸光度 A 为纵坐标，酪氨酸的浓度 c 为横坐标，绘制标准曲线(此线应通过零点) 。根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为 1 时的酪氨酸的量(ug)，即为吸光常数 K 值。其 K 值应在 95100 范围内。4、2 测定(1)待测酶液的制备a、称取酶粉 12g，精确至 0.0002g(或吸取液体酶 1.00 mL)，用少量该酶的缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，然后将上清液小心倾入容量瓶中，沉渣中再添加少量上述缓冲如此溶解、捣研 34 次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定
8、容至刻度，摇匀。用四层纱布过滤，滤液根据酶活力再一次用缓冲液稀释至适当浓度，供测试用(稀释至被测试液吸光值在0.250.40 范围内)。b、酶粉测定时，稀释倍数参考表 A4(液体酶亦可参照表 A4 稀释) 。表 A4酶活单位 总倍数 第一次稀释 第一次稀释2 万 2000 2g 200 mL（100 倍） 5 mL 100 mL（20 倍）3 万 2500 2g 500 mL（100 倍） 5 mL 50 mL（10 倍）4 万 4000 2g 200 mL（100 倍） 5 mL 200 mL（40 倍）5 万 5000 2g 500 mL（100 倍） 5 mL 100 mL（20 倍）9
9、、10 万 10000 2g 500 mL（100 倍） 5 mL 200 mL（40 倍）(2)测定a、先将酷素溶液放入 400.2恒温水浴中，预热 5min;b、按下列程序操作：试管 A(空白) 试管 B(酶试样，需作三个平行试样 )加酶液 1.00 mL 加酶液 1.00 mL400.2，2min加三氯乙酸 2.00 mL(摇匀) 加酪素 1.00mL(摇匀)400.2，10min 400.2，10min加酪素 1.00(摇匀) 加三氯乙酸 2.00mL(摇匀)取出静止 10min，过滤 取出静止 10min，过滤取 1.00mL 滤液 取 1.00mL 滤液加碳酸钠溶液 5.0mL 加
10、碳酸钠溶液 5.0mL加福林试剂使用液 1.00mL 加福林试剂使用液 1.00mL400.2 显色 20min 400.2 显色 20min于 680nm 波长，用 10mm 比色皿 于 680nm 波长，用 10mm 比色皿测其吸光度 测其吸光度c、1.398 和 166 蛋白酶，除反应与显色温度为 300.2外，其它操作同 4、2(2)。标准曲线作同样处理。5 计算X=AK4/10n=2/5AKn(A3)式中：X样品的酶活力， u/g(u/mL);A样品平行试验的平均吸光度;K吸光常数;4反应试剂的总体积，mL;10反应时间 10min，以 1min 计;n稀释倍数。所得结果表示至整数。
11、6 结果的允许差平行试验相对误差不得超过 3%。紫外分光光度法(第二法)1 原理蛋白酶在一定的温度与 PH 条件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。根据吸光度计算其酶活力。2 试剂和溶液同 2。3 仪器和设备3、1 恒温水浴 400.2。3、2 紫外分光光度计 应符合 GB 9721 的规定。4 分析步骤4、1 求 K 值按第一法( 4、1a)的表 A3 配制不同浓度的 L-酪氨酸标准溶液，然后，直接用紫外分光光度计测定其吸光度(A)，并计算 K 值(其 K 值应在 130135)范围内)。4、2 待测酶液的制备a
12、、称取酶粉 12g，精确至 0.0002g(或吸取酶液 1.00 mL),以下操作同 A242 中(1)a;b、测定酶粉时稀释倍数参考表 A5(液体酶亦可参照表 A5 稀释) 。表 A5酶活单位 总倍数第一次稀释第二次稀释2 5万810 万200040001g 200mL（200 倍）1g 10mL 100mL（10 倍）5mL 200mL（200 倍）100mL（20 倍）4、3 测定除酶液吸取 2.00mL、酪素吸取 2.00mL、三氯乙酸吸取 4.00 mL 外，其它操作条件同福林法测定( 4、2) 中的反应、静止沉淀，直到过滤。滤液用紫外分光光度计，在 275nm 波长下，用 10mm 比色皿，测定其吸光度(A) 。5 计算X=AK8/21/10n=2/5AKnE(A4)式中：X样品的酶活力， u/g(u/mL);A试样溶液的平均吸光度;K吸光常数;8反应试剂的总体积，mL;2吸取酶液 2.00mL，以 1min 计;1/10反应时间 10min，以 1min 计;n稀释倍数E紫外法与福林法的换算系数(中性、碱性蛋白酶系数为 0.50;酸性蛋白酶系数为 0.77)。所得结果表示至整数。7 结果的允许差平行试验测定值之差不得超过 3%。
