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1、实验十三、蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测（GB/T 5009.199-2003 蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测）酶制剂岳阳家政排毒养颜胶囊减肚子她他女鞋痔疮偏方毛孔大方法一 快速卡法一、目的要求：学习快速卡法测定有机磷农残快速检验法及熟悉检验结果评定。二、实验原理：胆碱脂酶可催化靛酚乙酸脂（红色）水解为乙酸与靛酚（蓝色） ，有机磷或氨基甲酸脂类农药对胆碱脂酶有抑制作用，使催化、水解、变色的过程发生改变，由此可判断出样品中是否有高剂量有机磷或氨基甲酸脂类农药的存在。三、实验试剂：1、固化有胆碱脂酶和靛酚乙酸脂试纸卡片；2、pH 7.5 磷酸盐缓冲液：分别称取 15
2、.0g 磷酸氢二钠Na 2HPO412H2O与 1.59g 无水磷酸二氢钾KH 2PO4，用 500 mL 蒸馏水溶解。四、实验步骤：1、整体测定法（1）选取具有代表性的蔬菜样品，擦去表面泥土，剪成 1cm 左右方形碎片,取 5g 防入带盖瓶中，加入 10 mL 缓冲溶液，振摇 50 次，静置 2min 以上 .(2) 取一片快速卡，用白色药片沾取提取液，放置 10min 以上进行预反应，有条件时在 37 恒温装置中放置 10min。预反应后的药片表面必须保持湿润。（3）将快速卡对折，用手捏 3min 或用恒温装置恒温 3min，使红色药片与白色药片叠合发生反应。注意：每批测定应设一个缓冲液的
3、空白对照。2、表面测定法（粗筛法）（1）擦去蔬菜表面泥土，滴 23 滴缓冲液在蔬菜表面，用另一片蔬菜在滴液处轻轻摩擦。（2）取一速片测卡，将蔬菜上的液滴滴在白色药片上。（3）放置 10 min 以上进行预反应，有条件时在 37 恒温装置中放置 10 min。预反应 10 min，预反应后的药片表面必须保持湿润。（4）将快速卡对折，用手捏 3min 或用恒温装置恒温 3min，使红色药片与白色药片叠合发生反应。注意：每批测定应设一个缓冲液的空白对照。五、检测结果判断：1、结果判断 结果以酶被有机磷或氨基甲酸脂类农药抑制（为阳性） 、未抑制（阴性）表示。与空白对照卡比较，白色药片不变色或略有浅蓝色
4、均为阳性结果。白色药片变为天蓝色或与空白对照卡相同，为阴性结果。对阳性结果的样品，可用其他方法进一步确定具体农药品种和含量。2、样品检测结果记录并对检测结果进行评价。六、实验注意事项及说明：1、速测卡灵敏度指标如下表所示。部分农药检出限参考表农药名称检出限（ mg/kg）农药名称检出限（mg/kg）农药名称检出限（mg/kg）甲氨磷 1.7 乙酸甲胺磷3.5 久效磷 2.5对硫磷 1.7 敌敌畏 0.3 甲萘盛 25水胺硫磷3.1 敌百虫 0.3 好年冬 1.0马拉硫磷2.0 乐果 1.3 呋喃丹 0.5氧化乐果2.32、速测卡法符合率：在检出的 30 份以上阳性样品中，经气相色谱法验证，阳性
5、结果的符合率应在 80%以上。3、葱、蒜、萝卜、韭菜、香菜、茭白、蘑菇和番茄汁液中，含有对酶有影响的植物次生物质，容易产生假阳性，处理样品时，可采取整株（体）蔬菜浸提或采用表面测定法。对一些含叶绿素较高的蔬菜，也可采取整株（体）蔬菜浸提法，减少色素的干扰。4、当温度条件低于 37，酶反应速度随之放慢，药片加液后放置反应的时间也应相对延长，延长时间的确定，应以空白对照卡用手指（体温）捏 3min 时可以变蓝，即可往下操作。注意样品放置的时间应与空白对照卡放置的时间一致才有可比性。空白对照卡不变色的原因：一是药片表面缓冲溶液加得少、预反应后的药片表面不够湿润；二是温度太低。5、红色药片与白色药片叠
6、合反应的时间以 3min 为准，3 min 后的蓝色会逐渐加深，24h 后颜色回逐渐退去。方法二 酶抑制率法（分光光度法）一、目的要求：学习酶抑制率法测定果蔬有机磷和氨基甲酸脂类农药残留的原理和方法，注意实验过程的操作要点。二、实验原理：根据有机磷和氨基甲酸酯类农药能抑制乙酰胆碱酯酶的活性原理，向蔬菜的提取液中加入生化反应底物碘化乙酰硫代胆碱和乙酰胆碱酯酶，如果蔬菜不含有机磷或氨基甲酸酯类农药残留或残留量低，酶的活性就不被抑制，实验中加入的底物就能被酶水解，水解产物与加入的显色剂反应产生黄色物质。如果蔬菜的提取液含有农药并残留量较高时，酶的活性被抑制，底物就不被水解，当加入显色剂时就不显色或颜
7、色变化很小。用分光光度计在 412nm 处或农药残毒快速检测仪测定吸光值，根据计算出的抑制率，就可以判断蔬菜中含有机磷或氨基甲酸酯类农药残留量的情况。三、实验试剂和仪器：（一）试剂1、pH8.0 缓冲液 分别称取 11.9g 无水磷酸氢二钾与 3.2g 磷酸二氢钾，溶解于 1000 mL 蒸馏水中。2、乙酰胆碱酯酶（实验专用酶） 根据酶活力用缓冲溶液溶解，3 min 的吸光值变化 A 0值应控制在 0.3 以上。摇匀后在 05冰箱中保存，保存期不超过 4 天。3、底物碘化乙酰硫代胆碱 称取 25.0 mg 碘化乙酰硫代胆碱，用 3.0 mL 缓冲溶液溶解，在 05下保存。保存期不超过 2 周。
8、4、显色剂 分别称取 160 mg 二硫代二硝基苯甲酸和 15.6 mg 碳酸氢钠，用 20 mL 缓冲溶液溶解，4冰箱保存。5、可选用由以上试剂配置的试剂盒。乙酰胆碱酯酶的 A 0 值应控制在 0.3 以上。（二）仪器 1、分光光度计或相应的农残快速检测仪；2、天平（0.01g） ；3、恒温水浴或恒温培养箱。四、实验步骤：1、样品处理选取有代表性的蔬菜样品，去掉不可食部分后称取蔬菜试样，冲洗掉表面泥土，剪成1 cm 左右碎片。取样品 1 g，放入烧杯或提取瓶中，加入 5 mL 缓冲液，振荡 12 min，倒出提取液，静置 35 min，待用。2、对照溶液测试先于试管中加入 2.5 mL 缓冲
9、液，再加入 0.1 mL 酶液、0.1 mL 显色剂。摇匀后于 37 放置 15 min 以上（每批样品的控制时间应一致） 。加入 0.1 mL 低物摇匀，此时检液开始显色反应，应立即放入比色皿中，记录反应 3 min 的吸光度的变化值 A 0。 3、 样品溶液测定先于试管中加入 2.5 mL 样品提取液，其他操作与对照测定相同，记录反应 3 min 的吸光度的变化值 A t。五、结果计算：抑制率（%） = 100At式中 A 0对照液反应 3 min 吸光度的变化值；A t样品溶液反应 3 min 吸光度的变化值。六、实验结果判断：当蔬菜样品提取液对酶的抑制率大于 50% 时，表示样品中有高
10、剂量的有机磷或氨基甲酸酯类农药残留，可判定样品为阳性结果，对检验结果阳性的样品需重复检验两次以上。检验结果记录：样品名称 A 0 A t 抑制率（ %）检验结果七、实验注意事项及说明1、对检验结果阳性的样品，需用其他方法进一步确定残留农药的种类和进行定量测定。2、酶抑制率法对部分农药的检出限为：农药名称 检出限（mg/kg） 农药名称 检出限（mg/kg）敌敌畏 0.1 氧化乐果 0.8对硫磷 1.0 甲基异柳磷 5.0辛硫磷 0.3 灭多威 0.1甲胺硫 2.0 丁硫克百威 0.05马拉硫磷 4.0 敌百虫 0.2乐果 3.0 呋喃丹 0.053、葱、蒜、萝卜、韭菜、香菜、茭白、蘑菇和番茄汁
11、液中，含有对酶有影响的植物次生物质，容易产生假阳性，处理样品时，可采取整株（体）蔬菜浸提或采用表面测定法。对一些含叶绿素较高的蔬菜，也可采取整株（体）蔬菜浸提法，减少色素的干扰。4、当温度条件低于 37，酶反应速度随之放慢，药片加液后放置反应的时间也应相对延长，延长时间的确定，应以胆碱酯酶空白对照测试的吸光度变化A 0 在 0.3 以上为准。注意样品放置时间应与空白对照溶液放置时间一致才有可比性。酶的活性不够和温度太低都可能造成胆碱酯酶空白对照液 3 min 的吸光度 A 0 变化值0.3。5、该法适用于大量蔬菜样本的筛检，不适用于最后的仲裁检测。八、思考题1、使用速测卡的注意事项有哪些？2、影响胆碱酯酶抑制检测法的因素有哪些？如何解决？3、可用何种检测方法对检验结果为阳性样品，进行进一步的定性和定量？
