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1、微生物来源的SOD制备与活力测定,1,SOD研究背景,一种金属酶类与细胞的需氧代谢密切相关存在广泛大量数据表明， 所有需氧细胞包括最简单的微生物体内都含有SOD。迄今人们已分别从细菌、真菌, 原生动物, 藻类, 昆虫, 植物（如茶叶, 大豆, 小麦叶片和小白菜等）, 动物（如肝脏、血液） 等生物材料中分离得到SOD。,2,依据 SOD分子中所含的金属离子不同，可大致分为以下三类：Cu/ Zn-SOD, Mn-SOD, Fe-SOD。此外，有研究表明，在牛肝中还发现一种Co/Zn- SOD。三类SOD的性质和存在,SOD研究背景,3,不同生物材料SOD含量差别很大, 既使同一生物, 不同组织中的
2、SOD含量差别也各不相同。 其中以动物肝脏组织中SOD含量最为丰富。 动物来源的SOD制备技术也最为成熟，主要是从动物肝脏和血液中提取。价廉而富含SOD的植物组织和微生物也是制备SOD的理想原料。,SOD研究背景,4,SOD是需氧微生物在有氧环境中生存的必要条件，细菌SOD主要是Mn-SOD和Fe-SOD，也有少量细菌中含有Cu/ Zn-SOD。本实验拟用伤寒沙门氏菌提取SOD,微生物细胞中SOD的提取纯化工艺,5,提取思路,培养细菌,微生物细胞中SOD的提取纯化工艺,破壁,离心收上清,盐析,溶解目的蛋白,阴离子离子交换色谱,洗脱,6,SOD等电点：4-5,SOD存在于胞浆,微生物细胞中SOD
3、的提取纯化工艺,具体操作 伤寒沙门氏菌,37，120r/min,摇床培养24h,4000r/min 离心 5min,收集细菌,55% 硫酸铵盐析 80%硫酸铵盐析,洗3次，悬浮于其中,菌体重悬液,超声波法破碎细胞,透析液,3000r/min,0.05mol/L pH7.8 磷酸钾缓冲液,分级沉淀,蛋白沉淀,20mmol/L 磷酸盐缓冲液,溶解,透析至外液不含NH4+,上清液,7,接种于LB培养基,微生物细胞中SOD的提取纯化工艺,依次用不同浓度pH7.8的磷酸钾缓冲液洗脱,20mmol/L 100ml, 30mmol/L 100ml, 30-100mmol/L 200ml,流速为0.5ml/m
4、in,洗脱液,旋转蒸发仪浓缩至1/3倍体积,浓缩液,过DEAE纤维素层析柱（DE-32）,DE-32 预先用10mmol/L磷酸钾缓冲液平衡,10-100mmol/L 磷酸钾缓冲液100ml,活性产物-30保存,8,透析液,过DEAE纤维素层析柱（DE-32）,DE-32 预先用20mmol/L磷酸钾缓冲液平衡,洗脱,含量测定-分光光度法 Mn-SOD与Fe-SOD在280nm有最大吸收 测样品A280，参考标准酪蛋白在A280处做出的标准曲线，确定浓度。SOD酶活测定-邻苯三酚自氧化法 SOD存在下，体系中邻苯三酚自氧化速率降低，自氧化中间产物积累减少。 连续测定体系的A420。 通过与不含SOD的空白组（自氧化速率控制在0.060A/min）做比较，计算出自氧化速率在0.030A/min时的酶量，即为一个酶活力单位。,SOD含量测定与活力测定,9,讨论,优点：本方法采用硫酸铵分级沉淀提取法，避免了因有机溶剂处理使SOD失活的缺点。而且可以同时分离得到Mn-SOD与Fe-SOD。不足：整个过程较为复杂，至少需要2-3次上柱层析总结： 从微生物中提取SOD主要受以下三个方面影响：提取方法、菌龄、菌种。 因此选取较好的细胞破壁方法，选用处于对数生长期后期、SOD含量高的需氧单核微生物可以提高收率。,10,谢谢！,11,
