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1、1一前期对一些重要试剂用量的评估(以 mRNA 100ng 为计算标准)1.如果原材料 0.2g(约 5 株 2 周苗期的苗),分成两管,每管 0.1g,则分别加 TRIzol 2ml(共 4ml),也就是说,每个生物 样品作两次生物重复的 话。每瓶 TRIzol 有100ml,所以可以做 25 个材料。2.一个材料作二次生物重复,需要 4 根 Zymo RNA 纯化柱。一个标准 Zymo Kit 有100 个反 应柱子,也就是可以做 25 个材料。3.RNA fragmentation 完整 Kit 可以做 100 个样品。4.mini/midi Kit 可以做 12 个柱子反应。二前期准备
2、工作1.DEPC 处理的 Rnase free 水;2.RNA 专用的 75%乙醇、异丙醇、三氯甲烷和 NaOAc;3.220烘烤6 小时的研磨棒、器皿和药匙;4.足够的液氮;三其它小知识理论上,每 100mg 材料可以获得 100-200ug total RNA,纯化后获得的 mRNA 的量约为 total RNA 量的 1/100。四具体实验步骤(一)TRIzol 提取总 RNA1先将研磨棒等用液氮预冷,然后加液氮粉碎叶片(组织),越细越好。2准备好 TRIzol 管,每 50-100mg 材料加入 1mlTRIzol(材料体积应小于2TRIzol 体积的 10%),振荡或用移液器打至无大
3、颗粒(震 荡 2 分钟可)。3悬液室温放置5min( 可 30min 放置) 。再加入 1/5V(起始体积)氯仿,剧烈振荡 1-2 分钟,室温放置 5min。然后 13000rpm 2-8 离心 30 min。4吸取无色上清(约有 1/2 的起始体积量),加入 1/2 V(起始体积)异丙醇。室温放置 10 min。然后 13000rpm 2-8 离心 30 min。5弃上清液。沉淀物以 75%乙醇洗涤(1ml 乙醇/1mlTRIzol)。然后13000rpm 2-8 离心 10min。6空转一次,吸去上清。7适当干燥 5 min。加入经 DEPC 处理的 Rnase free 水 100ul,
4、冰浴 1 小时。8检测:2l 电泳检测,另取 1l 稀释 10 倍后测 OD 值。9【用 RNase free 的 Dnase 酶切。 (一般 100ug 的总 RNA 中加 4%-5%V 的RNase inhibitor 和 10-20U 的 Dnase,然后 37 30 min)。】10 如果暂时不用,可以加 1/10V 的 3M PH5.5 的 NaOAc 和 3V 体积无水乙醇,-80放置 2 小时以上或 overnight。然后 12500rpm 2-8 离心15 min,重复 step 5-7。(二)从总 RNA 提取 mRNA(Oligotex mRNA Midi Kit)(RE
5、PEAT)(NOTE: Oligotex、OBB 先 37预热,然后振 荡, 25备用。OEB 70预热。)1根据以下表格依次混合在 1.5ml 微离心管内。 须充分混合。total RNAadd Rnase-free water to total RNA sample:Buffer OBB(l) Oligotex Suspension(l)10000 rpm 离心 1 min。2. 然后加 350l Wash Buffer 至离心柱, 以10000 rpm 离心 1 min。重复此步骤。3. 再以 10000rpm 空转离心 1 min。4. 将此小离心柱换入新的 Rnase-free 的
6、1.5ml 微离心管内。用 43l Rnase-free Water 洗脱,放置 1 min 后以10000 rpm 离心 1 min;重复此步骤,最后为 86l。5. 取 1l 电泳检测,另取 1l 稀释 10 倍后测 OD 值 。6. 加 1/10V 的 3M PH5.5 的 NaOAc 和 3V 体积无水乙醇,-80 30min-2 小时。7. 10000rpm 4离心 30min,弃上液,加 75%乙醇 400ul 洗,再 10000rpm 4离心 3min,弃上液,适当晾干 5min,溶解于 9ul Rnase free 水中(冰浴4放置 30min-2 小时)。(四)mRNA fr
7、agmentation1. 将 9ul 的 mRNA 样品转移到 200ul PCR 专用 tube 管中,再加10XFragmentation Buffer(Ambion,#AM8740)1ul,放置于 PCR 仪 70 度 5 分钟。2. 加入 1ul Stop Buffer(Ambion,#AM8740),立即置于冰上。3. 转移到 1.5ml 的 tube 管中,依次加入 1ul 3M NaOAc(PH5.2),2ul glycogen(Ambion,#AM9510),30ul 100% EtOH,-80 度放置 30 分钟。4. 以 14000rpm 4 度离心 25 分钟沉淀,弃上
8、液,加 75%乙醇 400ul 洗,再10000rpm 4离心 3min,弃上液,适当晾干 5min,溶解于 10.5ul Rnase free水中(冰浴放置 30min-2 小时)。(五)First strand cDNA synthesis1. 将 10.5ul 样品转移到 200ul PCR 专用 tube 管,然后加入 1ul Random Hexamer Primers(3ug/ul,Invitrogen,#48190-011),在 PCR 仪 65 度放置 5 分钟,立即置于冰上。2. 准备以下的 mixture,充分混合,保证能提供 7.5ul mixture 至一个样品。依次
9、5X first strand buffer(Invitrogen,#18064-014)4ul;100mM DTT(Invitrogen,#18064-014)2ul;dNTP mix(10mM)1ul;RnaseOUT(40U/ul)(Invitrogen,#10777-019)0.5ul3. 将 7.5ul mixture 加入样品中,充分与 样品混合,25 度放置 2 分钟。4. 加 1ul SuperScript II(200U/ul,Invitrogen,#18064-014)到样品中,按以下程序依次加热或置冷:25 度 10 分钟-42 度 50 分钟-70 度 15 分钟-4
10、度 hold(以上每个样品实际量为 20ul)5(六)Second strand cDNA synthesis1. 直接在样品加入 51ul 水。2. 依次加入 5XSecond strand buffer(Invitrogen,#10812-014)20ul,dNTP mix(10mM)3ul,充分混合,再冰上放置 5 分钟。3. 加入 RNaseH(2U/ul,Invitrogen,#18021-014)1ul,DNA Pol I(10U/ul,Invitrogen,#18010-025)5ul,充分混合,在 PCR 仪 16 度放置 2.5 小时。(以上每个样品实际量为 100ul)4. 进行样品 DNA 纯化(Qiagen ,#28106):即每个样 品中加 500ul PB,转入柱子中,12500rpm 离心 1 分钟,弃去下液,柱子中加 750ul PE,12500rpm 离心 1分钟,弃去下液,再空转 1 分钟,放置 1 分钟,柱子换入新的 tube 管中,加入 16ul EB 洗脱,再加入 16ul EB 洗脱第二次.5. 各取 2ul 测 OD 值。样品后续交给测序组,用 Illumina Genomic DNA Sample Prep Kit(#1000181)继续样品制备,上样测序。