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1、课题3 血红蛋白的提取和分离,专题5 DNA和蛋白质技术,2003年4月14日宣布人类基因组序列图完成这标志着进入了后基因组时代和蛋白质组时代。对蛋白质的研究和应用，首先要得到纯净的蛋白质。在本课堂中，我们就一起来学校蛋白质的提取和分离。,蛋白质的分离和提取的原理是什么？,根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。,思考,一、基础知识：, 凝胶色谱法（分配色谱法）：,1、凝胶：,一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，具多孔的凝胶就叫分子筛）,2、概念：根据被分离蛋白质相
2、对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离的方法。,3、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（ ）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（ ），移动速度（ ），而（ ）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（ ）移动，路程（ ），移动速度（ ），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。,4、具体过程,相对分子质量较小,较长,较慢,相对分子质量较大,凝胶外部,较短,较快,凝胶色谱法分离蛋白质的原理,1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。, 缓冲溶液：,2、作用： 能够抵制（ ）的
3、对溶液的（ ）的影响，维持PH基本不变。,外界的酸或碱,PH值,3、缓冲溶液的配制,通常由（ ）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（ ）就可以制得（ ）使用的缓冲液。,12,使用比例,在不同PH范围内,思考：说出人体血液中缓冲液。,NaH2PO4 / Na2HPO4,H2CO3 / NaHCO3,电泳：,1、概念：指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。,在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）,2、原理：许多重要的生物大分子，如（ ）等都具有( ) 在( )下，这些基团会带上
4、（ ） 。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其（ ） 移动。电泳利用了待分离样品中各种分子（ ）以及分子本身（ ）、（ ）的不同使带电分子产生不同的（ ），从而实现样品中各种分子的分离。,多肽、核酸,可解离的基团,正电或负电,所带电荷相反的电极,带电性质的差异,大小,形状,迁移速度,一定的PH,分类：,琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳。,测定（ ）通常用十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙稀酰胺凝胶电泳,蛋白质相对分子质量,为了消除净电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入( )。SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是( )。SDS
5、能与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于( )。,蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。,SDS,单条肽链的分子量,分子的大小,思考 人们用鸡的红细胞提取DNA，用人 的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？,鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。,样品处理粗分离纯化纯度鉴定,蛋白质的提取和分离一般分为四步：,二 实验操作,1.样品,血液,血浆,水分,固体物质,血浆蛋白,无
6、机盐磷脂葡萄糖等,血细胞,白细胞,血小板,红细胞（最多）,血红蛋白（ ）,两个a肽链,两个一肽链,共四条肽链,90,每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，可携带一分子氧或一分子二氧化碳。血红蛋白因含血红素而呈现红色。,（一）样品处理,1、红细胞的洗涤：目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液凝固；离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色血浆；用生理盐水洗涤，重复三次直至上清液不再呈现黄色。2、血红蛋白的释放：3、分离血红蛋白溶液：4、透析：,红细胞的洗涤,（一）样品处理,1、红细胞的洗涤：目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液凝固；离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色血浆；用生理盐水洗涤。2、血红蛋白的释
7、放：在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放3、分离血红蛋白溶液：离心分层；滤纸过滤去除脂溶性沉淀层；分液漏斗分出红色透明液体。4、透析：,分离血红蛋白溶液,有机溶剂 无色透明的甲苯层,脂类物质 白色薄层固体（脂溶性物质沉淀层）,血红蛋白溶液 红色透明液体,红细胞破碎物沉淀 暗红色沉淀物,（一）样品处理,1、红细胞的洗涤：目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液凝固；离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色血浆；用生理盐水洗涤。2、血红蛋白的释放：在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放3、分离血红蛋白溶液：离心分层；滤纸过滤去除脂溶性沉淀层；分液漏斗分出红色透明液体。4、透析：装入透析袋并置于磷酸缓冲液中
8、（PH为7.0）透析。,透析过程,视频（3.38）,（二）凝胶色谱操作,（1）凝胶色谱柱的制作： 取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。底塞的制作：打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。顶塞的制作：打孔安装玻璃管。组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。安装其他附属结构。,（2）凝胶色谱柱的装填,凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。75表示凝胶的
9、得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。 凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。,视频（2.14）,洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时，使凝胶装填紧密。注意：1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响
10、液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。,（3）样品加入与洗脱,调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。 滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。 样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。 洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。 收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集
11、。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功） 注意：正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、使吸管管口沿管壁环绕移动。,视频（6.30）,（三）纯度鉴定,使用最多的是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。,二、实验操作,蛋白质的提取和分离一般分为四步：（1）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白的释放；离心等操作收集血红蛋白溶液。（2）粗分离：透析除去分子较小的杂质。（3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。（4）纯度鉴定：通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。,视频（2.14）,练习巩固,1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是A
12、弄清各种蛋白质的空间结构B 弄清各种蛋白质的功能C 弄清各种蛋白质的合成过程D 获得高纯度的蛋白质,2、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质D 二者根本无法比较,3、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A 电荷的多少 B 分子的大小C 肽链的多少 D 分子形状的差异4、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是A 调节pH B 维持红细胞的能量供应C 防止微生物生长 D 防止血液凝固,5、一分子血红蛋白最多可携带的 O2分子数或者CO2分子数分别是A 4、2 B 4、4 C 2、1 D、1、16、记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后分层顺序自上而下是：有机溶剂-脂类物质-血红蛋白溶液-红细胞破碎物沉淀,
