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1、黄芪总黄酮对小鼠的急性毒性及致突变性研究王沙沙 1，郭泽，王平，张冲，王莹，张雪梅 *延边大学农学院动物医学系，吉林 延吉 133002摘要：本试验采用小鼠最大耐受量法、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验和小鼠精子畸形试验等方法研究黄芪总黄酮的急性毒性、致突变性。结果显示，黄芪总黄酮的小鼠急性经口最大耐受剂量(MTD) 大于 15 g/kg.bw，小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验和小鼠精子畸形试验结果均为阴性。结果表明，黄芪总黄酮属无毒物，对小鼠体细胞、雄性生殖细胞均无致突变性。关键词：黄芪总黄酮；小鼠；急性毒性；致突变性Acute Toxicity and Mutagenicity of Total
2、Flavonoids of Astragalus in miceWANG Sha-sha , GUO Ze , WANG Ping, ZHANG Chong, WANG Ying,ZHANG Xue-mei*Department of Animal Medicine, Agricultural College of Yanbian University, Yanji, Jilin, 133002Abstract: The acute toxicity and mutagenicity of total flavonoids of Astragalus was investigated. Acu
3、te toxicity test with the maximum tolerance dose, bone marrow polychromatic erythrocytes micronucleus test and sperm deformity test in mice were adopted. The results showed that the acute oral maximum tolerated dose (MTD) of total flavonoids of Astragalus mice were higher than 15 g/kg.bw, bone marro
4、w polychromatic erythrocytes micronucleus test and sperm deformity test in mice were negative. The results proved that the total flavonoids of Astragalus is non-toxic, and non-mutagenic on somatic cells and male germ cells in mice.Key words: Total flavonoids of Astragalus; mice; acute toxicity; muta
5、genicity黄芪又称黄耆，为豆科多年生草本植物，药用历史悠久，古有“补药之长”之称 1。黄芪性温、味甘、归脾肺经，临床应用多为蒙古黄芪干燥根，有补中益气、温养脾胃之功效 2。黄芪具有分布广泛、易人工种植、炮制方法简单、药用价值高等优点 3。黄芪的主要成分包括黄芪总黄酮、黄芪多糖、黄芪皂苷、生物碱及多种微量元素等 4。黄芪总黄酮(Total Flavonoids of Astragalus, TFA)作为黄芪的主要活性成分，具有清除自由基、抗氧化、抗衰老的作用 5，能显著增强小鼠的免疫功能 6，还具有体外抗炎等活性 7。国内外基金项目：国家自然科学基金项目（31260622）作者简介：王沙沙
6、(1992)，女，吉林榆树人，硕士研究生，研究方向为兽医药理学与毒理学通讯作者：张雪梅，教授，博士。Tel: 0433-2435537 ，E-mail: zhangxm 对黄芪总黄酮药理作用的报道很多，但是对其急性毒性、致突变性均无报道。本试验采用小鼠急性经口毒性试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验和小鼠精子畸形试验等方法，对黄芪总黄酮的急性毒性、致突变性进行研究。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 试验药品黄芪总黄酮，购自南京泽朗医药科技有限公司；环磷酰胺(CP)，购自江苏恒瑞医药股份有限公司；羧甲基纤维素钠(CMC)，购自天津科密欧化学试剂有限公司；瑞士姬姆萨染色液(Wright-Giem
7、sa Stain)，购自珠海贝索生物技术有限公司。1.1.2 试验动物昆明种雌雄小鼠，购自延边大学实验动物中心。饲养于独立通风笼盒，自由采食，维持 12 h 光照/黑暗的节律，正式试验前均适应喂养 3 d。1.2 方法1.2.1 小鼠急性经口毒性试验本试验采用最大耐受量法进行试验 8。昆明种小鼠 1822 g，20 只，雌雄各半。TFA配制成浓度为 0.25 g/ml 混悬液。小鼠禁食不禁水 16 h，称重，间隔 4 h 以 0.3 ml/10 g BW灌胃两次，总剂量为 15 g/kg BW。立即观察并连续定时观察 14 d，记录小鼠中毒症状、死亡情况及出现时间。1.2.2 小鼠骨髓嗜多染红
8、细胞微核试验本试验采用 30 h 试验法 8。昆明种小鼠 2530 g，25 只，随机分成 5 组，分别为 CMC阴性对照组，环磷酰胺 40 mg/kg BW 阳性对照组，TFA 10、5、2.5 g/kg BW 三个剂量组。小鼠称重，间隔 24 h 以 0.225 ml/10 g BW 灌胃 2 次，第二次给予受试物 6 h 处死。取小鼠股骨骨髓制片，自然干燥，甲醇固定，Wright-Giemsa 染色。油镜观察，每只小鼠 200 个PCE，计数相同区域内的成熟红细胞(NCE)，计算 PCE/(PCE+NCE)比值；每只小鼠 1 000个 PCE，记录出现微核的 PCE 数，计算微核发生率。
9、1.2.3 小鼠精子畸形试验 8昆明种雄性小鼠 1822 g，25 只，随机分成 5 组，分别为 CMC 阴性对照组，环磷酰胺40 mg/kg BW 阳性对照组，TFA 10、5、2.5 g/kg BW 三个剂量组。小鼠称重，以 0.15 ml/10 g BW 每天定时灌胃三次，连续 5 d，首次给予受试物 35 d 处死。取小鼠双侧附睾，置于生理盐水中，剪碎、过滤，吸取滤液涂片，干燥，甲醇固定。镜下观察，每只小鼠 1 000 个结构完整的精子，计数畸形精子类型及数目，计算精子畸形率。1.2.4 统计学分析试验数据采用 SPSS 17. 0 统计学软件进行分析，以平均数标准差（ s）表示，组间
10、比较采用单因素 ANOVA( Dunnets t-test) t 检验方法，P 0.05 表示差异具有统计学意义。2 结果2.1 小鼠急性经口毒性试验小鼠在 14 d 观察期内，未见任何中毒反应并无死亡状况，表明 TFA 对小鼠经口最大耐受量大于 15 g/kg BW。据急性毒性分级标准，TFA 被判定为无毒。2.2 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验本试验 PCE/(PCE+NCE)比值均处于正常范围，表明试验结果可靠。结果显示 CP 阳性对照组微核率与 CMC 阴性对照组比较，差异有统计学意义； TFA 各剂量组微核率与 CP阳性对照组比较，差异有统计学意义，与 CMC 阴性对照组比较，差异无统
11、计学意义。见表 1。表 1 TFA 对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率的影响Table 1 Effects of TFA on micronucleus rate of bone marrow polychromatic erythrocytes in micePCE/(PCE+NCE) 微核组别Groups剂量g/kg BWPCE NCE 比值(%) PCE 微核数 微核率()阳性对照组Positive group0.04 1000 524 0.660.06 5000 99 19.808.41*10 1000 787 0.560.02 5000 23 4.603.85#5 1000 697 0.6
12、00.08 5000 17 3.402.70#黄芪总黄酮组TFA groups2.5 1000 786 0.560.05 5000 21 4.204.60#阴性对照组Negative group 1000 758 0.570.05 5000 19 3.804.32注：与阴性对照组比较，*P 0.05，*P 0.01；与阳性对照组比较， #P 0.05， #P 0.01。Note: Compared with the negative group, *P 0.05, *P 0.01; Compared with the positive group, #P 0.05, #P 0.01.2.3 小
13、鼠精子畸形试验CP 阳性对照组精子畸形率与 CMC 阴性对照组比较，有极显著性差异；TFA 各剂量组微核率与 CP 阳性对照组比较，均有极显著性差异，与 CMC 阴性对照组比较，差异无统计学意义。结果表明 TFA 各剂量不能引起小鼠精子畸形率增高。见表 2。表 2 TFA 对小鼠精子畸形的影响Table 2Effects of TFA on sperm deformity in mice畸形精子类型及个数 (个)组别Groups剂量g/kg BW精子总数(个)无钩香蕉型胖头无定型卷尾双头双尾总数畸形率()阳性对照组Positive group0.04 5000 214 74 156 69 56
14、0 15 18 1106 221.249.8*10 5000 29 12 32 28 58 2 1 162 32.49.8#5 5000 36 16 25 27 97 7 5 213 42.618.1#黄芪总黄酮组TFA groups2.5 5000 37 15 47 15 104 2 6 226 45.215.8#阴性对照组Negative group 5000 40 15 29 17 98 3 2 204 40.819.0注：与阴性对照组比较，*P 0.05，*P 0.01；与阳性对照组比较， #P 0.05， #P 0.01。Note: Compared with the negativ
15、e group, *P 0.05, *P 0.01; Compared with the positive group, #P 0.05, #P 0.01。3 讨论本试验采用的小鼠急性经口毒性试验是毒理学安全性评价第一阶段最基础性的试验 9，结果表明，TFA 对小鼠经口最大耐受量大于 15 g/kg BW，判定为无毒级。本试验的致突变性研究采用两种方法，其中小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验是检测环境诱变因子的遗传毒理学技术 10，小鼠精子畸形试验用于特异性检测环境理化因子对雄性哺乳动物生殖细胞的遗传性损伤 11。本试验以 CP 为阳性对照物，CP 属氮芥类烷化剂，为常用临床抗癌药，但有抑制骨髓、抑
16、制免疫功能和遗传毒性等毒副作用 12。有研究显示TFA 对化学物诱导的 DNA 损伤具有一定的保护作用，即 TFA 有抗突变作用 13，但未对TFA 的毒性作出评价。本试验两项致突变性试验结果均呈阴性，分别从染色体水平、基因水平表明 TFA 无致突变性。因此，在临床治疗中，TFA 具有抗肿瘤、抗突变等药理活性，同时具有毒副作用小等优点，值得开发利用。参考文献：1 吴大真, 余传隆, 袁钟, 等. 中医辞海: 中册M. 中国医药科技出版社. 1999: 1226.2 熊辅信. 临床中药辞典M. 云南科技出版社. 1988: 51-3.3 中华人民共和国国家药典委员会. 中华人民共和国药典: 一部M. 北京: 化学工业出版社, 2010: 212.4 侯团章. 中草药提取物M. 中国医
