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1、1生物防治可行性研究报告项目名称：防治大白菜根肿病生防菌的筛选2一、 研究题目防治大白菜根肿病生防菌的筛选二、义：根肿病主要危害十字花科植物，如油菜、白菜、青菜、甘蓝、抱子芥、榨菜、萝卜、芜菁等。一些花园植物如香雪球、庭荠、缎花、胡椒草、紫罗兰、糖芥等有时也被感染。绝大多数野生十字花科植物包括野芥子、菥萁、野芥菜、野萝卜、黄花山芥菜、山芥等易被侵染。木犀草(木犀草科)、虞美人(罂粟科)、红三叶草(豆科)和草地生黑麦草(禾本科)等非十字花科植物在人工接种时也可被侵染 1。 病原菌( 为鞭毛菌亚门根肿菌目根肿菌属的芸薹根肿菌。病原菌在寄主根部肿大的细胞内形成休眠孢子囊，孢子囊密集呈鱼卵块状，球形，
2、单胞，无色或略带灰色，膜壁光滑。孢子囊萌发产生游动孢子，游动孢子椭圆形或近球形，直径为 侧着生不等长尾鞭式双鞭毛，可在水中短距离游动。根肿病菌的生活史可划分为 3 个阶段，即在土壤中存活、侵染根毛阶段和侵染皮层阶段 2。条件适宜时休眠抱子萌发释放出 1 个具有一长一短 2 条鞭毛的游动抱子， 肾形或椭圆形、近球形;游动抱子可借助土壤中的水分进行游动，经过一段时间后鞭毛脱落而囊化形成休止抱;休止抱萌发是形成一管状结构穿透寄主细胞壁，将原生质注入寄主细胞内，发育成原质团 3 。该病菌休眠孢子萌发的最适温度为 24,最适 为 死温度为 45,光对孢子萌发有明显抑制作用。该菌休眠孢子在感病寄主的根分泌
3、物溶液中萌发率最高,达 75%。此外,耐病甘蓝品种及非十字花科作物如番茄的根分泌物均能刺激其孢子萌发 4。病原菌以休眠孢子囊在土壤和带有病残体未腐熟的厩肥中越冬越夏。休眠孢子囊在土壤中的存活力很强,可存活 10a 以上。病菌靠流水、雨水、灌溉水和土壤中的线虫、昆虫的活动以及农事操作,在田间传播。远距离传播则主要通过带病根的菜苗、菜株的调运或带菌泥土的转移。土壤中的休眠孢子囊,在适宜条件下,萌发产生游动孢子,侵入根毛表皮细胞内,形成变形体。变形体通过寄主细胞分裂,蔓延到新的细胞,或穿过细胞壁而进入皮层、形成层的细胞内。受害细胞由于受病菌的刺激而大量分裂、膨大,导致根部形成肿瘤。维管束组织受增生细
4、胞的挤压,发育不正常,输导系统不能连贯,致使植株吸收水分和养料困难。因此,病株表现生长迟缓和叶片萎垂,直至整株死亡。 5当前食品的安全问题已经备受人们关注，生物防治法对环境污染和破坏作用小，而且对人几乎没有什么危害，由于生防菌与化学农药相比，具有安全性、研究时间短和科研经3费少等特点，目前世界各国的研究人员对其研究比较多，在我国近些年也有比较多的学者对其研究。十字花科根肿病最早于 1737 年在英国地中海西岸和欧洲南部发现 6，各个国家的学者很早就开始研究，由于根肿病不能人工培养对其研究比较难，目前已有的防治方法效果并不理想。在我国大白菜种植区域的根肿病爆发严重而且有逐年增加的趋势，没有有效的
5、防治方法给我国的大白菜生菜带来严重损失，研究大白菜根肿病生物防治技术对我国白菜生产将有重大的意义。月秋等报道过从大白菜根际土壤中分离到一株枯草芽抱杆菌 株室内防治效果达 85%，田间防效 7。其次近些年国内外已经有部分人从白菜的土壤中筛选出对根肿病有作用的菌种，但是效果不太好正在改进当中。于化学防治速度快，效果高，杀病虫谱广，成本低，使用简便等，农业生产主要依靠化学农药。一种新的化学农药一般需要 10的时间，所花的费用也比较高，会造成污染和残毒，杀伤天敌，破坏自然环境和生态平衡，而微生物农药只需要 3究的费用也比较低，加之具有：对人畜安全无毒，不污染环境，无残留；对病害的特异性强，不易伤及天敌
6、和有益生物，能保持生态平衡；对病原物压低而不是消灭，多种有效成分和因素发挥作用，病原物难产生抗药性；生产原料和有效成分属天然产物，能回归自然保证可持续发展；可用现代生物技术和基因工程方法对微生物改进性能和提高质量等特点 10，化学农药的研究已经开始缓慢下降，生物农药的研究在逐年的增加，具有广阔的应用前景。年来研究生防菌的学者比较多，但根肿病生防菌的研究不多，相关报道较少。范成明 9从大白菜根际分离的枯草芽孢杆菌 处理在直栽 60d 内的大白菜没有明显症状，在收获期，两个菌株的防治效果分别达 张艳 9采集健康的茶树，红豆树，银杏树和白菜的根、茎、叶、枝条等组织，分离出生防细菌 衣处理对白菜的防效
7、最高，盆栽试验防效达到 杨力凡 8利用上海交通大学的深绿木霉( 变菌株 根肿休眠抱子萌发有明显的抑制作用，田间防治效果达到 王静 11从茶树、红豆树、银杏树、白菜及油菜的根际土壤和根、茎、叶、枝条等材料中，分离出放线菌菌株 根肿病具有防效，2 菌株对白4菜根肿病的室内盆栽防效分别为 国外，韩国从 20 世纪末开始进行根肿病研究，在常规抗病育种的同时进行分子学研究。Y 等完成大白菜抗根肿病基因位点的确定和基因图谱的绘制，正在进行用 法克隆根肿病抗性基因的研究 12。申请了抗根肿病基因 韩国的专利 13；14从小麦、油菜、大白菜和象草地里生长的大白菜根中分离根殖真菌，在消毒土壤中，其中 16 个菌
8、株可以完全抑制根肿病菌，2 株根部内生菌 自然土中也可减轻根肿病的发生。 6等从荃菜叶片中分离得到能有效控制根肿病的茎点霉 972，通过对其活性物质进行分离、纯化发现抑制根肿病菌的物质为顶环氧菌素(氟甲基)234-(三氟甲基 ) 一二硝基苯胺， 250ug/可起作用) 。17等通过温室和田间试验发现，3 个木霉菌株( 1 个链霉菌菌株(以显著的减轻新西兰十字花科根肿病的发生。18等发现放线菌 有机肥混用时对防治根肿病有效。19等从韩国大白菜根部分离到 81 株内生放线菌，其中有 3 株在室内对十字花科根肿病有较好防效，2 株 效分别为 58%和33%，1 株 效达 42% 。三、生菌的分离从各
9、地采集土壤和植物的组织，在不同培养基上进行培养，以获得各种菌落。菌内生菌的筛选及鉴定将分离出的菌落进行单胞分离，取患根肿病的组织分离休眠孢子，用分离出的菌株做抑菌试验，选择对根肿病具有防治作用的菌株，在进行形态学特征的鉴定以确定有防效的菌株。生菌定植能力的测定菌株的定植能力的强弱是筛选生防菌株的重要指标，可通过植能力的强弱来确定生防菌株的应用潜力。毒力菌株的选育筛选出的野生菌株生产力低，一般不能满生产上的需要，需要对野生菌株进行人工育种改造。可应用紫外线和化学实试剂诱变处理，使菌株毒力和生产力提高。室试验5在温室进行盆栽试验，以确定具有生防效果的菌株。田试验温室内环境条件比较简单，选育出的菌株
10、在田间效果如何，还得进行大量田间试验。过分离鉴定可得到目标菌株，但是菌株生物生长繁殖受外界环境变化影响。四、器设备超净工作台，高压灭菌锅，离心机，搅拌器，显微镜，细菌过滤器，恒温培养箱，研钵，移液枪等。试培养基(1)养基：马铃薯 2009，葡萄糖 209，琼脂 209，蒸馏水 1000)磷酸二氢钾 19，硫酸镁几 5 名，蛋白陈 59，葡萄糖 109，脂 209，蒸馏水 10003)养基:牛肉膏 59，蛋白脉 59，氯化钠 59， 脂 209，蒸馏水 10004)硝酸钾 19，磷酸氢二钾 酸镁 化钠 酸亚铁 溶性淀粉 209，琼脂 159，蒸馏水 1000mL， )养液，其成分如下:1000液
11、含 :液含 :03):液含:3伽 4液含: 离采集的材料根肿病病田中未发病白菜及油菜根、茎、叶、枝条等组织，并在它们的根际周围采集3土壤（( 20，将所采集的样品装入新的聚乙烯塑料袋中，土壤在6室温条件下放置 7进行分离，植株组织放入 4冰箱保存并进行分离。原菌菌种来源采自发病较重的 A 地区，20保存。验品种的选择白菜品种选择高感根肿病。白菜根内生菌的分离土壤内生菌的分离称取所采集的土样 10g 于三角瓶中，加入 90菌水，28摇床 180r/荡 30得 10壤稀释液，然后吸取 1释度为 10壤稀释液加到有 9菌水的试管中振荡，制成 10壤稀释液，用同法制成 100 0 0别编号 12采用平
12、板涂布法进行分离，用移液枪吸 100上制好的悬浮液，将之加入预先做好的平板培养基上，用 L 型玻棒涂匀。待长出菌落后，挑取形态、大小、色泽不同的菌落，进行纯化。将纯化后的单菌落转移到斜面培养基上，于 4冰箱保存备用。植株组织内生真菌的分离取采集的植株根、茎、叶、枝条等组织，用水冲洗干净后，用 70%酒精表面消毒 5氯酸钠消毒 1菌水冲洗 3。无菌条件下将经处理的各组织用消过毒的刀片切成 2方的小块放于马丁培养基上，每皿放 3组织小块，并吸取少量表面消毒中最后一次冲洗材料的无菌水作对照，以检测表面消毒是否彻底。在 25下恒温培养，待各组织的切面处长出菌丝后，挑取菌丝尖端部分，转接于固体培养基上获得纯培养物，并于 面中保存菌种队 21植株组织内生细菌的分离称取适量的根、茎、叶、枝条等组织材料，表面消毒后(表面消毒方法内生真菌的分离方法) ，无菌条件下加 10菌水充分研磨，将组织研磨液梯度稀释成 500 倍和 1000 倍稀释倍数的组织稀释液，分别取 100 林 L 涂布到 板上。28培养 2 一 3d
