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1、Hoechst/PI 双染检测细胞凋亡PI、Hoechst33342 均可与细胞核 DNA（或 RNA）结合。但是 PI 不能通过正常的细胞膜，Hoechst 则为膜通透性的荧光染料，故细胞在处于坏死或晚期调亡时细胞膜被破坏，这时可为 PI 着红色。正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst 着色，但是正常细胞核的 Hoechst 着色的形态呈圆形，淡兰色，内有较深的兰色颗粒；而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色，或核呈分叶，碎片状，边集。故 PI 着色为坏死细胞；亮兰色，或核呈分叶状，边集的 Hoechst 着色的为调亡细胞。电子天平准确称取 1mg 碘化丙啶（propidium iodide
2、，PI）溶于 10ml PBS（PH 7.2），成 100ug/ml 的储备液，用前等量混合（注意避光）protocol:1、收集细胞，数量需 1210E6 个（悬浮细胞直接吹起即可，对于贴壁细胞用胰酶消化时，最好用 DMEM+胰酶消化,且消化过程中不要去移动瓶子，防止消化所形成的细胞团影响后面的染色及分析），离心，11,000rpm，5min。2、 用 1ml 冰冷的 PBS 重悬后，离心：11,000rpm ，5min 。3、用 200l 冰冷的 PBS 重悬后，用加样器混匀后，缓慢的加入含有 4ml 冰冷的 70乙醇的 10ml 离心管中，边加边摇匀。20，过夜。（或者置 4，1h 后进
3、行下一步）4、1,500rpm，10min，小心弃上清后，用 1ml 冰冷的 PBS 重悬，1,500rpm，5min 。小心弃上清。5、 加入含有 40g/ml 的 PI，100g/ml 的 RNase 的 PBS 溶液 500l，37，培养 30min1h。混匀。溶液配方：PBS 910lPI 80lRNase 10l共 1ml6、过滤，供流式检测。Hoechst 33342/PI 双染色法紫外光激发, Hoechst-PI 双染在荧光显微镜下可见 4 种细胞形态:活细胞(VN) ,染成蓝色 ,核呈正常结构;早期凋亡细胞(VA) ,染成蓝色,核呈固缩状或圆珠状;晚期凋亡细胞(NVA) ,也
4、被染成红色,但可见明显的染色质凝集。非凋亡的死亡细胞(NVN) ,染成红色,核呈正常结构;贴壁细胞：1、培养细胞中加入 hoechst 染液，终浓度 5g/ml；2、37，避光染色 10min，3、继续加入的 PI 染液，终浓度 15g/ml，4、4，避光反应 10min，5、荧光显微镜下观察，照相。悬浮细胞：1.悬浮生长的细胞在培养状态下加入 Heochst 33342，终浓度为 1g/ml；帖壁生长的细胞用含有 0.02EDTA 的 0.2 5胰蛋白酶消化成单细胞悬液，离心，弃上清，用 1ml 全培养液重悬细胞，加入 Heochst 33342，终浓度为 1g/ ml，37孵育 710mi
5、n。24 5001000r/min 离心弃去染液。3加入 1.0ml PI 染液，4避光染色 15min。4400 目的筛网过滤 1 次。5流式细胞仪分析。另外这是活细胞染色，还有固定后染色的：细胞处理完毕用甲醇：冰醋酸（3：1）在 4 度固定 5min 后，PBS 漂洗，进行以上操作。先染色后固定：Hoechst33258 染色法1原代细胞培养，细胞学涂片或细胞甩片机制备的单细胞片。2细胞固定液 4固定 5min。3蒸馏水稍洗后，点加 Hoechst33258 染色液，10min。4蒸馏水洗片后，用滤纸沾去多余液体。5封片剂封片后荧光显微镜观察。Hoechst33342 染色法1将 Hoec
6、hst33342 加入培养的细胞中，终浓度为 10g/ml 37孵育 30min。24的多聚甲醛和培养液以 1：3 混合，使多聚甲醛的浓度为 1，固定细胞 510min。3固定好后，将细胞悬液涂在载玻片加盖玻片。4荧光显微镜激发滤片选用 UV 激发滤片，阻断滤片为 400500nm 。以上是先将细胞染色后再行固定观察的方法，也可先固定后染色：1收集（0.53.0）10 6 个细胞，5001000r/min，离心 5min 去上清。2PBS 洗 1 次，5001000r/min，离心 5min 去 PBS。3用 3多聚甲醛 50l 重悬细胞，室温下固定 10min。4PBS 洗 1 次，5001
7、000r/min 离心 5min 去 PBS。5用 15l 的 Hoechst33258 或 33342 重悬细胞，终浓度为 16g/ml，孵育 15min。6取 10l 放在玻片上，荧光显微镜下观察，可数 500 个细胞，计算调亡率。注意事项：1、-20 度 70%乙醇固定细胞过夜，固定后可以放在-20 度冰箱，一般能保存几个月；2、染色前要用 DNA 抽提缓冲液（PC buffer）作用 5 分钟，；3、加 PI 的量按照 1PI，106 个细胞 5l；4、加 RNAase 是为了消化 RNA，以免影响 DNA 分析的结果。操作过程，不用一定强调无菌，但是干净点没错的。一般来说都采用 用 Hoechest-PI 双染，正常细胞对染料有拒染性，萤光着色浅，凋亡细胞主要摄取 Hoechest 染料呈现强兰光，而坏死细胞主要摄取 PI 呈红色荧光。
