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1、1高氧肺损伤中肺细胞凋亡及 JNK 信号通路调控机制作者：胡兰，许峰，李静，方芳，匡凤梧，王兴勇，卢仲毅【摘要 】 目的： 观察高氧暴露下肺组织细胞凋亡和磷酸化cJun 氨基末端激酶（pJNK ）蛋白表达的变化，并探讨 JNK 信号转导通路对高氧诱导的肺细胞凋亡的调控机制. 方法： 48 只 3 wk龄 Wistar 大鼠随机分为空气对照组、高氧暴露 3，7，14 d 组、空气JNK 抑制剂干预组、高氧暴露 7 d JNK 抑制剂干预组. 光镜下观察肺组织病理学改变，末端标记法（TUNEL）分析肺组织细胞凋亡的变化，免疫组化检测肺组织 pJNK 的表达分布，Western Blot 检测肺组织
2、 pJNK 蛋白质的表达含量. 结果： 与空气对照组比较，高氧暴露各时间点组肺组织出现典型急、慢性肺损伤的病理学改变，肺组织细胞凋亡指数和 pJNK 蛋白表达含量均显著增加（P0.05） ，肺组织 pJNK 阳性细胞明显增多. JNK 抑制剂SP600125 在空气和高氧暴露下均能明显阻断 JNK 的激活（P0.05） ，SP600125 干预后高氧暴露肺组织细胞凋亡指数显著减少（P0.05） . 结论： 细胞凋亡是高氧肺损伤的一个重要病理组织学特点. JNK 信号转导通路在高氧肺损伤中被激活，可能发挥促细胞凋亡效应. 2【关键词】 cJun 氨基末端激酶；氧/毒性；肺/损伤；细胞凋亡0 引言
3、氧疗是临床上用于改善组织缺氧状态的一种常用治疗手段，然而长时间持续吸入高浓度氧，可致活性氧(reactive oxygen species，ROS)大量产生，导致肺氧化应激性损伤1-2. 近年来研究1-3表明细胞凋亡可能是高氧肺损伤的一个重要组织学特点. cJun 氨基末端激酶(CJun NH2terminal kinase，JNK)信号转导通路是丝裂原活化蛋白激酶(motigenactivated protein kinases，MAPKs) 家族中的重要通路之一4 ，其在体内是否参与了高氧肺损伤的发病机制并介导高氧诱导的肺细胞凋亡，目前还少见报道. 我们以幼年 Wistar 大鼠为研究对象
4、，观察高氧下肺组织细胞凋亡及磷酸化JNK(pJNK) 蛋白表达的变化，以探讨 JNK 信号转导通路对高氧诱导的肺细胞凋亡的调控机制.1 材料和方法1.1 材料清洁级 3 wk 龄 Wistar 大鼠 48 只,体质量 4050 g，雌雄不限（重庆医科大学动物中心提供）. 原位细胞凋亡检测试剂盒（德国 Roche 公司） ；SP600125( 美国 Sigma 公司)；pJNK兔多克隆抗体(美国 Cell Signaling Technology 公司) ；磷酸甘油醛3脱氢酶(GAPDH)mAb（上海康成生物工程有限公司） ；powervisionTM twostep 免疫组化检测试剂盒和辣根过
5、氧化酶（HRP）标记山羊抗兔 IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司） ；二辛可宁酸（BCA）蛋白定量检测试剂盒（上海生工生物工程有限公司） ；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（BioRad 公司） ；增强化学发光法（ECL）试剂盒（美国 Pierce 化学品公司） .1.2 方法1.2.1 动物分组及高氧模型制备采用随机数字表法将 48 只大鼠分为空气对照组、高氧暴露 3，7 ，14 d 组、空气JNK 抑制剂干预组、高氧暴露 7 dJNK 抑制剂干预组 6 组（n=8 ）. 将高氧组置于有机玻璃氧仓中，连续行吸入氧体积分数（FiO2）监测，保证FiO2950 mL/L；空气对照组置于同室空气中（F
6、iO2=210 mL/L） ；JNK 抑制剂 SP600125 干预组动物经腹腔注射 SP600125 30 mg/kg，药物一次性给予，给药 2 h 后予高氧或空气暴露 7 d. 各组环境温度控制在 2125，湿度 50%60%, 并于每日0900 开箱 10 min，清洁有机玻璃氧仓，添加饲料及饮水.1.2.2 标本采集空气对照组（空气暴露第 7 日取标本） 、高氧暴露组（分别在高氧暴露第 3，7 ，14 日取标本） 、JNK 抑制剂干预组（分别在干预后再空气暴露和高氧暴露第 7 日取标本）动物以 35 4mL/L 水合氯醛（10 mL/kg）腹腔麻醉，开胸，结扎右中肺，剪左心耳，于右心室
7、注入含肝素的生理盐水灌洗肺循环血管，直到左心房流出的液体清亮为止. 分离肺组织，生理盐水漂洗干净，滤纸吸干水分，右中肺经 40 g/L 多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，5 m 切片，HE 染色，光镜下检查肺组织病理变化；同时行细胞凋亡检测及免疫组化检测. 其余部分置于-70冰箱保存，行 pJNK Western Blot 检测.1.2.3 肺组织细胞凋亡检测采用 TUNEL 检测. 切片脱蜡至水，加入蛋白酶 K 工作液，21 37反应 1530 min，30 mL/L H2O2 室温下（1525）封闭 10 min，滴加 50 L TUNEL 反应混合液（酶反应液与标记液的比例为 19）湿盒中 3
8、7避光湿润反应 1 h，再滴加 50 L ConverterPOD,湿盒中 37避光湿润反应 30 min，DAB 显色，苏木素复染，脱水，透明，封片 . 结果判断和图像分析： 胞核呈现棕黄色为阳性细胞. 每张切片随机选 5 个高倍镜(400) 非重叠视野，应用北航病理真彩色图像软件分析系统CM2000B，记数每个视野的凋亡指数（阳性细胞数/总细胞数100） ，再求均值.1.2.4pJNK 在肺组织中表达和分布的检测采用二步法免疫组化检测. 切片脱蜡至水，30 mL/L H2O2 封闭内源性过氧化物酶510 min，热修复抗原，血清封闭 20 min，滴加一抗（1100 ） ，54过夜，二抗为
9、 HRP 标记山羊抗兔 IgG（11000） ，37孵育20 min，DAB 显色，苏木素轻度复染，脱水，透明，封片 . 结果判断：胞核和/或胞质呈现棕黄色为阳性细胞 .1.2.5pJNK 蛋白含量检测采用 Western Blot 方法检测. 改良 RIPA 裂解液 (mmol/L)（TrisHCl 50，NaCl 150，EDTA 1，NaF 50，Na4P2O7 2.5，Na3VO4 1，Triton X100 10 mL/L，甘油 100 mL/L，SDS 1 g/L，脱氧胆酸钠 5 g/L，leupetin 100 mol/L，PMSF 1）提取肺组织总蛋白（每 100 mg 组织加
10、入0.5 mL 裂解液） ， BCA 比色法定量. 取 100 g 待测蛋白按序加样，SDSPAGE 电泳后 100 V 4 转移至 PVDF 膜上，50 g/L 脱脂牛奶常温下封闭 1 h，滴加一抗 pJNK（11000 ）4孵育过夜，HRP 标记的二抗（ 12500）常温孵育 1 h，ECL 化学发光曝光 5 min，由 ChemiDocXRS 图像采集系统（美国 BioRad 公司）采集图像. 结果分析采用 Quantity One 4.5.0 软件读取各个目的蛋白条带的校正积分光密度值，以 GAPDH 作为内参照，pJNK 蛋白含量用 ApJNK /AGAPDH 表示.统计学处理：实验
11、数据以 xs 表示，用 SPSS13.0 统计软件进行分析，多样本均数比较用单因素方差分析，组间两两比较用LSDt 检验，P0.05）. 而高氧暴露 3，7，14 d 组肺组织中可见大量的 TUNEL 阳性细胞，其凋亡指数均显著高于空气对照组（P0.05） ，尤以高氧暴露 3，7 d 明显，高氧暴露 14 d 稍有回落. 高氧暴露 7 dJNK 抑制剂干预组较高氧暴露 7 d 组肺组织TUNEL 阳性细胞则明显减少，两者凋亡指数比较有显著性差异（P0.05，表 1）. 凋亡细胞主要见于肺泡上皮细胞、小气道上皮细胞及血管内皮细胞，部分巨噬细胞及间质细胞也呈凋亡改变.表 1 各组肺组织细胞凋亡指数
12、及 pJNK 蛋白含量的相对变化（略）7aP0.05 vs 空气对照； cP0.05 vs 高氧 7 d； eP0.05 vs 高氧 14 d.2.3pJNK 阳性细胞在肺组织中表达和分布的变化空气对照组肺组织偶有少量 pJNK 阳性细胞表达，高氧暴露各组肺组织阳性细胞则明显增多，以高氧暴露 7 d 组增多最为明显. 空气JNK抑制剂干预组较空气对照组肺组织阳性细胞稍有减少，高氧暴露 7 dJNK 抑制剂干预组较高氧暴露 7 d 组肺组织阳性细胞明显减少. 阳性细胞广泛分布于肺泡上皮细胞、小气道上皮细胞、血管内皮细胞、巨噬细胞、间质细胞及浸润炎症细胞（图 1）.2.4 肺组织 pJNK 蛋白表
13、达含量的变化空气对照组肺组织仅有少量 pJNK 蛋白表达，高氧暴露 3，7，14 d 组肺组织 pJNK蛋白表达含量显著增加. 空气JNK 抑制剂干预组及高氧暴露 7 dJNK 抑制剂干预组肺组织 pJNK 蛋白表达含量较相应未干预组均显著减少（P0.05 ，图 2，表 1） ，表明 JNK 抑制剂SP600125 在空气和高氧下均能特异性阻断 JNK 的激活.3 讨论高氧肺损伤是弥散性肺泡炎和损伤后修复重建的复杂病理生理过程，其肺损伤早期特征性改变是肺泡上皮受损，继之出现成纤8维细胞增生，最终导致肺纤维化的发生5. 目前认为细胞凋亡在高氧肺损伤的发病过程中具有十分重要的作用，可导致肺组织气血
14、屏障受损和间质水肿，并可能由其激活成纤维细胞及损害细胞的修复过程，从而最终导致肺纤维化6-9 ，但其具体机制仍不清楚.A： 空气对照组； B： 高氧暴露 3 d 组； C： 高氧暴露 7 d 组； D： 高氧暴露 14 d 组； E： 空气JNK 抑制剂干预组； F： 高氧暴露 7 dJNK 抑制剂干预组. ： 肺泡上皮细胞； ： 血管内皮细胞； ： 巨噬细胞.图 1 各组 pJNK 阳性细胞在肺组织中表达和分布的变化免疫组化400（略）A： 空气对照组； B： 高氧暴露 3 d 组； C： 高氧暴露 7 d 组； D： 高氧暴露 14 d 组； E： 空气JNK 抑制剂干预组； F： 高氧暴
15、露 7 dJNK 抑制剂干预组.图 2Western Blot 检测各组肺组织 pJNK 蛋白含量的变化（略）本实验结果显示，与空气对照组比较，高氧暴露各组肺组织中凋亡细胞明显增加；凋亡细胞主要见于肺泡上皮细胞、小气道上9皮细胞及血管内皮细胞，部分巨噬细胞及间质细胞也呈凋亡改变. 进一步证明，肺细胞凋亡是高氧肺损伤的一个重要组织病理学特点，且在高氧暴露急性期（高氧暴露 3，7 d）肺细胞凋亡效应显著，慢性期（高氧暴露 14 d）有所减弱，此与王安茹等10 报道一致. 值得一提的是，在高氧肺损伤慢性期亦有较多凋亡细胞，说明其可能与肺泡修复延迟、成纤维细胞增生及肺纤维化有关.JNK 又称为 SAPK，通常认为具有诱导细胞死亡及炎
