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1、1高氧性肺损伤中 MAPK 信号途径的表达及其作用机制【摘要】 目的： 探讨丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路三亚族ERK，p38，JNK 在大鼠高氧性肺损伤动物模型中的表达及作用. 方法： 24 只 3 周龄 Wistar 大鼠随机分成 4 组：空气对照组和高氧暴露 3，7 和 14 d 组，每组动物 6 只. 高氧暴露组置于常压高氧仓中（O295） ，空气对照组置于常压空气中（O2=21）. 光镜下观察肺组织病理学改变，采用二步法免疫组化检测磷酸化ERK，p38，JNK 在肺组织中的分布. Western Blot 检测磷酸化MAPK 蛋白表达变化. 结果： 高氧暴露 3，7 d 组出
2、现急性肺损伤的典型病理学特征，高氧暴露 14 d 组肺间质及纤维细胞增生明显. 免疫组化显示空气对照组仅肺泡上皮细胞及气道上皮细胞见少量磷酸化 ERK，p38，JNK 阳性表达，高氧暴露组则阳性细胞明显增多，广泛分布于肺内细胞中：肺泡上皮细胞、气道上皮细胞、胸膜间皮细胞、浸润炎细胞及间质纤维细胞, p38 阳性表达尤多见于炎性细胞中. Western Blot 显示高氧暴露组较空气对照组磷酸化蛋白表达明显增强，ERK，JNK 高氧暴露 7 d 组表达最强（P0.05） ， p38在高氧暴露 14 d 组表达最为明显（ P0.05）. 结论： 高浓度氧可激活 MAPK 信号途径，磷酸化 ERK，
3、p38，JNK 在高氧损伤肺组织表达明显增加，MAPK 三亚族 ERK，p38，JNK 活性变化在时间上并不具有同步性. 2【关键词】 高氧症；急性病；肺/损伤； MAP 激酶信号系统；ROS氧疗是治疗新生儿呼吸窘迫综合症的有效方法之一，但长时间暴露在高氧状态下会导致肺上皮细胞死亡、急性肺损伤甚至呼吸功能衰竭1. 尽管高氧介导的肺损伤机制目前尚不完全清楚，但已经证实丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen activated protein kinases, MAPK)信号转导途径与多种氧化应激性疾病密切相关2-3. 我们以幼年 Wistar 大鼠为研究对象，复制高氧肺损伤动物模型，观察 MAPK
4、 信号通路中 3 个主要亚族成员细胞外信号调节蛋白激酶（extracellularsignal regulated protein kinase, ERK） ，cJun 氨基末端激酶/应激激活的蛋白激酶（JNK/SAPK）,p38 激酶在不同高氧暴露时间段肺组织的分布以及蛋白表达，并分析 MAPK信号转导途径与高氧肺损伤的关系.1 材料和方法1.1 材料3 周龄 Wistar 大鼠 24 只（4050 g） ，由重庆医科大学动物中心提供. phosphop44/p42, phosphop38, 3phosphoSAPK/JNK 兔多克隆抗体购自美国 Cell Signaling Technol
5、ogy 公司；GAPDH mAb 为上海康成生物工程有限公司产品；powervisionTM twostep 免疫组化检测试剂盒以及 HRP 标记山羊抗兔 IgG 为北京中杉金桥生物技术有限公司产品； BCA 蛋白定量检测试剂盒购自上海生工生物工程有限公司；PVDF 膜为BioRad 产品； ECL 化学发光试剂盒(Super Signal West Pico Chemiluminescentsubstrate)购自美国 Pierce 化学品公司.1.2 方法1.2.1 动物分组及高氧模型制备采用随机图标法将 24 只大鼠分为 4 组：空气对照组，高氧暴露 3,7 和 14 d 组. 高氧暴露
6、组置于有机玻璃氧仓中，连续行氧浓度监测，保证 O295%；空气对照组置于同室空气中（O2=21% ）. 各组环境温度控制在 2125，湿度 50%60%, 并于每日09：00 开箱 10 min，清洁有机玻璃氧仓，添加饲料及饮水.1.2.2 标本采集以 35 mL/L 水合氯醛（10 mL/kg）腹腔麻醉，开胸，结扎右中肺. 剪左心耳，于右心室注入含肝素的生理盐水灌洗肺循环血4管，直到左心房流出的液体清亮为止，分离心、肺. 滤纸吸干水分，右中肺经 40 g/L 多聚甲醛固定，石蜡包埋，5 m 切片，HE 染色，光镜下检查肺组织病理变化；同时行免疫组化检测肺组织磷酸化MAPK 抗体的分布，其余部
7、分置于-70 冰箱保存，行phosphop44/p42， p38，SAPK/JNK Western Blot 检测.1.2.3 二步法免疫组化检测MAPK 在肺组织中的分布切片脱蜡至水，30 mL/L H2O2 封闭内源性过氧化物酶 510 min，热修复抗原，血清封闭 20 min，滴加一抗，分别为磷酸化 ERK 多克隆抗体（1250） ，磷酸化 p38 多克隆抗体（11000 ） ，磷酸化 JNK 多克隆抗体（1100） ，4过夜. 二抗为 HRP 标记山羊抗兔 IgG（11000） ，37 20 min 孵育. DAB 显色，苏木素轻度复染，脱水，透明，封片 . 结果判断： 胞核和/或胞
8、质呈现棕黄色为阳性细胞 .1.2.4 肺组织胞浆蛋白提取和定量滴加液氮于研钵粉碎组织块，加入改良 RIPA 缓冲液（Tris HCl 50 mmol/L，NaCl 150 mmol/L, EDTA 1 mmol/L, NaF50 mmol/L, Na4P2O7 2.5 mmol/L，Na3VO4 1 mmol/L，Triton X100 10 mL/L，甘油 100 mL/L，SDS 1 g/L，脱氧胆酸钠 5 5g/L， leupetin 100 umol/L，PMSF 1 mmol/L. 每 100 mg 组织加入 0.5 mL RIPA 裂解液，充分匀浆，冰浴作用 30 min, 4 1
9、2 879 g 离心 30 min. 此操作过程均在冰上进行以防止蛋白降解. 取上层液体-20 保存. 用 BCA 比色法测定蛋白质浓度.1.2.5 磷酸化 ERK，p38 ，JNK 蛋白含量检测用 Western Blot 方法，制备 12%分离胶以及 5积层胶，取待测蛋白 50 g 加样， SDSPAGE 电泳后 100 V 4转移至PVDF 膜上， 50 g/L 脱脂牛奶常温下封闭 1 h，分别滴加一抗phosphop44/p42，phosphop38 ，phosphoSAPK/JNK （均11000 ）4孵育过夜，辣根过氧化酶标记的二抗（12500）常温孵育 1 h，ECL 化学发光曝
10、光 5 min，用 Quantity one ChemiDocXRS 图像采集系统及分析软件（美国 BioRad 公司）对蛋白条带进行分析处理,蛋白含量用目的条带校正容积（ Adj volume）/GAPDH 校正容积（ Adj volume）表示.统计学处理： 计量数据以 xs 表示，采用 SPSS 11.5 分析软件多组间比较用单因素方差分析，两两组间差别比较采用 LSDt检验，P0.05 为差异有统计学意义.2 结果62.1 肺组织病理学观察空气对照组肺组织肉眼观无明显异常. 高氧暴露 3 和 7 d 组肺组织体积增大，表面点状或斑片状出血，切面见液体流出，呈充血水肿状；光镜见肺泡上皮细
11、胞肿胀，肺泡腔和肺间质水肿，炎性细胞浸润，肺泡结构紊乱，尤以高氧暴露 7 d 组更明显. 高氧暴露14 d 组肺组织体积较 3 和 7 d 组略小，肺表面见斑片状改变，光镜下肺泡上皮水肿减轻，炎性渗出减少，肺间质及纤维细胞增生明显.2.2 磷酸化 MAPK 蛋白在肺组织的分布空气对照组偶有少量磷酸化 ERK，p38，JNK 阳性表达，主要见于肺泡上皮细胞及气道上皮细胞，高氧暴露组则阳性细胞明显增多，广泛分布肺泡上皮细胞、气道上皮细胞、胸膜间皮细胞以及浸润炎症细胞、支气管黏膜下水肿间质的纤维细胞. p38 尤其高表达于大量浸润炎性细胞. 三种 MAPK 蛋白表达的细胞类型基本相同(图 1).2.
12、3 肺组织磷酸化 ERK/p38/JNK 蛋白含量变化与空气对照组比较，各高氧暴露组 ERK/p38/JNK 蛋白表达7明显增强. phosphoERK，phosphoSAPK/JNK 在高氧暴露 7 d组表达最为明显（P0.05） ， phosphop38 在高氧暴露 14 d 组表达最为明显（P0.05 ，图 2，表 1）. 表 1 各组肺组织 MAPK 蛋白含量相对变化（/GAPDH） （略）3 讨论MAPK 是一类丝苏氨酸激酶家族，能介导大量细胞外应激的细胞反应，如炎症细胞因子、热休克、紫外线照射、机械牵张刺激、渗透压应激等4-6. MAPK 家族最重要的 3 个亚族中，p38和 JN
13、K 属于“应激诱导” 的 MAPK，而 ERK 被认为是与细胞增殖、转化和分化相关的 MAPK.免疫组化显示 ERK，JNK，p38 在空气对照组仅少量表达于肺泡上皮细胞及气道黏膜上皮，高氧刺激后上述 MAPK 家族成员被激活，且肺内多类细胞参与了此种过程，除肺泡上皮、气道上皮外，还包括浸润炎症细胞、胸膜间皮细胞、间质纤维细胞，尤其 p38 阳性表达显著见于单核细胞、内皮细胞和中性粒细胞等炎性细胞内，这与之前研究发现 p38 的激活主要见于炎症反应相吻合，进一步提示了 p38 是 MAPK 家族参与炎症反应最重要的成员7-9.近年发现在许多细胞体系中，活性氧自由基（reactive 8oxyg
14、en species, ROS）能激活 MAPK 通路而调控细胞的增殖、分化、生存及凋亡10-11 ，但是在不同的细胞，不同的刺激模型，氧化应激激活 MAPK 的报道不尽相同. Han 等12 从高氧暴露的大鼠肺组织悬液收集培养肺泡型上皮细胞，发现 ERK 被激活而p38，JNK 活性却无明显改变. 而用于生成胞内超氧阴离子的吩嗪硫酸甲酯能激活仓鼠肺成纤维细胞（V79）JNK 以及 p38,却对ERK1/2 无活化作用13.本研究发现，在高氧暴露 3 d 时，即可检测到有明显的 JNK活性增加；在发生急性肺水肿最显著的高氧暴露 7 d 组，ERK 及JNK 的活性表达最强，而 p38 最强表达
15、则在有纤维化表现的高氧暴露 14 d 组. Carvalho 等14给予原代肺泡型上皮细胞 H2O2刺激，ERK，JNK ，p38 亚族均被激活，也发现它们激活的时间显著不一致，说明 ROS 激活 MAPK 三亚族活性变化在时间上并不具有同步性,至于高氧刺激通过何种机制导致 MAPK 信号亚族激活的不同步性，尚需更深入的研究.【参考文献】1Zhang X, Shan P, Sasidhar M, et al. Reactive oxygen species and extracellular signaregulated kinase 1/2 mitogenactivated protein
16、kinase mediate hyperoxiaunduced cell death in lung epitheliumJ. Am J 9Respir Cell Mol Biol, 2003,28(3):305-315.2Mossman BT, Lounsbury KM, Reddy SP. Oxidants and signaling by mitogenactivated protein kinases in lung epitheliumJ. Am J Respir Cell Mol Biol, 2006 ,34(6):666-669. 3Romashko J 3rd, Horowitz S, Franek WR, et al. MAPK pathways mediate hyperoxiainduced onc
