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1、精品文档2016 全新精品资料-全新公文范文 -全程指导写作 独家原创 1 / 12转染抑癌基因 PTEN 对人乳腺癌 ZR751 细胞的细胞周期和增殖能力的影响 作者：李祥勇，林观平，周克元 【关键词】 人乳腺癌 ZR 【摘要】目的：观察 PTEN（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，第 10 号染色体上磷酸酶和张力蛋白同源缺失的基因）对人乳腺癌细胞 ZR751细胞增殖和细胞周期的影响。方法：利用脂质体介导法将携带有野生型和突变型 PTEN cDNA 的真核表达载体pBPwtPTEN 和 pBPG129RPTEN
2、 导入人乳腺癌 ZR751 细胞（质粒转染成功后实验分为 CWTPTEN 组、CG129RPTEN 组和未转染质粒组即对照组）后，以 RTPCR、Western blot 分析目的基因的表达，并采用 MTT 法和流式细胞术检测细胞增殖和细胞周期。 结果：CWTPTEN 组、CG129RPTEN 组细胞 PTEN mRNA 及 PTEN 蛋白出现明显的高表达。CWTPTEN 组细胞生长的抑制率可高达 42.7%，与对照组比较，差异有显著性(P0.05)。流式细胞术显示 CWTPTEN 组细胞周期从 G1 期到S 期已发生抑制。结论：野生型 PTEN 可依赖其磷酸酶活性抑制肿瘤细胞的增殖，并最终诱
3、导细胞凋亡。 【关键词】 人乳腺癌 ZR751 细胞； PTEN 基因；细胞周期 【Abstract】 Objective: To investigate the effect of the PTEN (phosphatase and tensin homologue 精品文档2016 全新精品资料-全新公文范文 -全程指导写作 独家原创 2 / 12deleted on chromosome ten) gene on cell cycle and proliferation in human breast cancer cell line ZR751. Methods: The eukary
4、otic expression vector pBPwtPTEN and pBPG129RPTEN containing PTEN cDNA was transfected into ZR751 cells by lipofectamine. Three groups were set: CWTPTEN, CG129RPTEN and cells without transfection as the control group. Reverse transcriptionpolymerase chain reaction and Westernblot methods were used t
5、o detect PTEN expression in the transfected ZR751 cells. The cell cycle, cell proliferation and cell apoptosis of the ZR751 cells was determined by the MTT and flow cytometry. Results: High expression of PTEN mRNA and protein was seen in the transfected ZR751 cells. The proliferation of CWTPTEN cell
6、s were inhibited by 42.7% (vs the control group, P 0.05). The cell cycle from G1 to S of CWTPTEN cells was inhibited. Conclusion: Wide type PTEN gene might suppress the growth and induces the apoptosis in human breast cancer cell line ZR751 cells through its phosphatase activity. 【Key words】 ZR751;
7、PTEN; cell cycle; 精品文档2016 全新精品资料-全新公文范文 -全程指导写作 独家原创 3 / 12proliferation PTEN（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，第 10 号染色体上磷酸酶和张力蛋白同源缺失的基因）是继 p53 基因之后新近发现的与各种肿瘤密切相关的一个抑癌基因，其突变与缺失见于多种恶性肿瘤，如前列腺癌、胶质瘤、乳腺癌等。目前发现 PTEN 是唯一一个编码具有双重磷酸酶活性的抑癌基因1 ，因其凭借磷酸酶活性负调控 PI3K/Akt 信号传导途径而备受关注。虽有研究表明
8、，PTEN 的缺失与突变与乳腺癌的发生发展密切相关2 ，然而目前有关 PTEN 基因对乳腺癌细胞生长抑制的作用多集中在对乳腺癌组织的研究，而 PTEN 基因转染对人乳腺癌细胞的研究不多。本实验以外源性 PTEN 基因导入该基因内源性缺失的乳腺癌细胞 ZR751 中，通过RTPCR、Western blot 分析目的基因的表达；同时采用 MTT法和流式细胞术检测转染后 PTEN 基因对 ZR751 细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响，以探讨其在乳腺癌细胞株生长抑制过程中的作用机制。 1 材料与方法 11 材料 人乳腺癌细胞株 ZR751 由医学科学院基础医学研究所提供。pBPwtPTEN 及 pBP
9、G129RPTEN 质粒由美国加州大学 Ludwig 癌症研究所 Furnari 教授惠赠。胰蛋白酶为美国 Gibco 公司精品文档2016 全新精品资料-全新公文范文 -全程指导写作 独家原创 4 / 12产品，胎牛血清为杭州四季青微生物材料工程公司产品。Trizol 试剂购自美国 Invitrogen 公司，嘌呤霉素、DNA Ladder 、DEPC、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺等购自美国Sigma 公司。RTPCR 反应试剂盒购自 QIAGEN 公司。小鼠抗人 PTEN 单克隆抗体、山羊抗人 Actin 多克隆抗体、EXL 发光试剂盒购自 Santa Cruz 生物技术公司。HRP 标记山羊
10、抗小鼠 IgG、 HRP 标记马抗山羊 IgG 等其它试剂购自北京中山生物技术有限公司等国内公司。PTEN、GAPDH 引物由上海生工公司合成。 12 方法 1.2.1 细胞培养 ZR751 细胞培养于含体积分数为 15%胎牛血清，100U/mL 青霉素和 100 mg/L 链霉素的 RPMI1640 完全培养液中，同时细胞培养液加入 0.5U/mL 胰岛素，并将细胞于 37 、体积分数为 5%CO2 饱和湿度孵箱中培养，经过消化传代，取对数生长期的细胞进行实验。 1.2.2 质粒转染 按照 Lipofectamine 2000 说明书分别将编码人野生型 PTEN 的真核表达质粒 pBP wt
11、PTEN 和突变型PTEN 质粒 pBPG129RPTEN 转染对数生长期的 ZR751 细胞，以1.5 mg/L 嘌呤霉素持续筛选 3 周，挑选阳性细胞克隆，扩增培养。分别将成功转染 pBP wtPTEN 和 pBPG129RPTEN 质粒的 ZR751 细胞命名为 CWTPTEN 细胞和 CG129RPTEN 细胞，称为 CWTPTEN 组和 CG129RPTEN 组。未转染的 ZR751 细胞作精品文档2016 全新精品资料-全新公文范文 -全程指导写作 独家原创 5 / 12阴性对照称为对照组。 1.2.3 RTPCR 法检测转染前后 PTEN 基因的表达 用质量分数为 0.25%胰蛋
12、白酶消化，收集培养 CWTPTEN、CG129RPTEN和 ZR751 细胞。制成悬浮液并计算细胞数，每个样本收集等量细胞（3.0106） ，用 Trizol 等试剂分别提取 CWTPTEN细胞、CG129RPTEN 细胞和 ZR751 细胞中的总 RNA，总 RNA沉淀溶解于 DEPC 处理过的无 RNase 的三蒸水中。采用RTPCR 反应试剂盒鉴定各转染细胞 PTEN mRNA 的表达，利用引物合成软件 Premier 5 和 oligo 6 自我设计PTEN（373bp）引物序列为：PTEN/ sense primer: 5 aaa gct gga aag gga cga ac 3；P
13、TEN/antisense primer: 5 cag gta acg gct gag gga ac 3 ； GAPDH/sense primer: 5 gaa ggt gaa ggt cgg agt c 3；GAPDH/antisense primer: 5 gaa gat ggt gat ggg att tc 3 。RTPCR 反应体系：50 30 min(RT 反应)，95 15min（预变性） ，94 45sec（变性） ，55 1min（退火） ，72 1min（延伸） ，共 30 个循环，72 10min（后延伸） ；PCR 产物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳后观察结果，图像分析软件
14、BandScan 4.3 进行光密度积分值分析，计算出 PTEN mRNA 与内参照 GAPDH mRNA 的光密度积分值比作为 PTEN mRNA 的相对含量值。 1.2.4 Westernblot 检测 PTEN 蛋白的表达 用 0.25%胰蛋精品文档2016 全新精品资料-全新公文范文 -全程指导写作 独家原创 6 / 12白酶消化，收集培养 CWTPTEN 细胞、CG129RPTEN 细胞和ZR751 细胞。制成悬浮液并计算细胞数，每个样本收集等量细胞（5.0106） ，加入细胞裂解液，提取蛋白质，以质量分数 10%聚聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，然后将蛋白电泳转移到硝酸纤维膜（PVDF
15、）上，硝酸纤维膜上加入质量分数 10%脱脂奶粉封闭后，加入一抗工作液（小鼠抗人 PTEN单克隆抗体，工作浓度为 1300） ，4 过夜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（14 000） ，ECL 发光试剂进行显像后拍照，图像经扫描仪扫描后，用 Scion Image 图像分析软件进行光密度积分值(Integral of optical density，IOD)分析，计算出各目的蛋白表达量与内参照GAPDH 蛋白表达量的光密度积分值之比作为目的蛋白表达量的相对含量值。每个图像均重复分析 3 次，取平均值。 1.2.5 MTT 法检测不同 PTEN 表达质粒对细胞的增殖况 分别取 CWTPTEN 细胞、CG129RPTEN 细胞和 ZR751 细胞在含15%FCS 的 RPMI1640 培养中培养 48h 后，加入 10 mg/mL MTT 10L，继续培养 4h，在加入 100L /孔的 DMSO，取出后，用酶标仪测定吸光度 A570 nm，结果取 3 个平行孔的均值，重复 3 次实
